По мере старения населения число страдающих деменцией людей, по прогнозам ученых, к 2050 г. возрастет до 115 млн, что, несомненно, создаст значимую проблему для здравоохранения [1]. Клинически заболевание проявляется прогрессирующей потерей памяти и постепенным снижением когнитивных функций [2]. Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется значительной потере нейронов и синапсов, особенно в гиппокампе и коре больших полушарий, внеклеточным накоплением β-амилоида и формированием нейрофибриллярных сплетений [3]. Однако диагноз устанавливается, как правило, на стадии значительного повреждения головного мозга, что существенно снижает эффективность лечения [4]. Большое значение может иметь идентификация молекул-маркеров, позволяющая выявить заболевание на ранних стадиях у людей с высоким риском развития слабоумия.

Результаты недавних исследований свидетельствуют о ключевой роли инсулинорезистентности в развитии когнитивных нарушений и нейродегенерации, в частности при БА [5, 6].

Нарушение передачи сигналов инсулина в головном мозге инициирует сигнальные каскады реакций, включающих ингибирование фосфатидилинозитид-3 киназы (PI3K) и протеинкиназы В (Akt-киназы) и активацию 3β-киназы гликогенсинтазы (GSK-3β), которая индуцирует гиперфосфорилирование тау-белка, накопление Аβ-олигомеров и окислительный стресс, приводящий к митохондриальной дисфункции, апоптозу клеток, секреции провоспалительных цитокинов и нейродегенерации [7].

Кроме того, нарушение эффектов инсулина может вызвать или усилить процессы нейровоспаления, способствующие развитию нейродегенерации [8]. Нейровоспаление характеризуется активацией микроглии и астроцитов, резко возрастающей продукцией провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), формированием внутриклеточных мультибелковых комплексов (инфламмасом), способствующих формированию синаптической и когнитивной дисфункции [9]. Инфламмасомы активируют каспазы 1 и 5, которые запускают секрецию провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-18, IL-33), инициируя нейровоспаление c последующим возникновением когнитивных расстройств и слабоумия [10].

Имеются данные о существенном вкладе инфламмасом в развитие инсулинорезистентности, что предполагает существование связи между формированием инфламмасом в клетках головного мозга и локальной инсулинорезистентностью при нейровоспалении и нейродегенерации [11]. Согласно предложенной гипотезе, нарушение церебрального метаболизма глюкозы, связанное с инсулинорезистентностью, запускает каскад патологических реакций, а именно митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс, эксайтотоксичность, апоптоз, активацию провоспалительных цитокинов, и, следовательно, способствует накоплению β-амилоида и гиперфосфорилированию тау-белка, тем самым вызывая когнитивную дисфункцию и нейродегенерацию [12].

Одним из потенциальных молекул-маркеров инсулинорезистентности является инсулинрегулируемая аминопептидаза (IRAP). Эта цинк-содержащая металлопептидаза обеспечивает протеолиз нейропептидов (в частности, окситоцина и вазопрессина) [13]. Ее ингибирование улучшает память у экспериментальных животных [14]. IRAP участвует в развитии нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с инсулинорезистентностью [15]. Этот фермент колокализован в клетках с инсулинозависимым глюкозным транспортером GLUT4, регулирует его внутриклеточный транспорт и, вероятно, может участвовать в механизме развития инсулинорезистентности, сопряженной с нарушением транслокации GLUT4 к мембране [16].

Таким образом, БА представляет собой, по-видимому, нейроэндокринное расстройство, связанное с мозгоспецифическим нарушением инсулин/IGF-сигнальных механизмов, т. е. «диабет 3-го типа». Однако молекулярный механизм нарушения передачи сигналов инсулина в нейронах остается в значительной степени неизвестным.

Цель настоящей работы — изучение экспрессии молекул-маркеров, а именно, IRAP, GLUT4 и IL-18 в различных областях головного мозга (гиппокамп, обонятельная луковица) у крыс с экспериментальной БА.

Крысам опытной группы (10 самцов в возрасте 7 мес) с помощью стереотаксической установки (Narishige, Япония) в СА1 зону гиппокампа с каждой стороны вводили по 5 мкл бета-амилоида 1−42 (Sigma-Aldrich, США). Использовали стереотаксические координаты ML±2,2 мм, АР — 3,0 мм, DV — 2,8 мм. Бета-амилоид 1−42 растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS, Sigma-Aldrich, США) до концентрации 2 мкг/мкл с последующей агрегацией в термостате при 37 °C в течение 7 дней [17]. Контрольную группу составили 10 крыс, которым в те же участки мозга вводили PBS. Животных содержали в клетках со свободным доступом к воде и корму при постоянной температуре 21±1 °С и регулярном световом цикле 12 ч день/12 ч ночь. Эксперименты проводились в соответствии с принципами гуманности, изложенными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/EC).

Оценку признаков БА начинали с 10-х суток после оперативного вмешательства [18].

На 14-й день после операции осуществляли транскардиальную перфузию 4% параформальдегидом с последующим забором головного мозга. Мозг фиксировали в 4% нейтральном забуференном формалине, после чего погружали в 20% раствор сахарозы и хранили при +4 °С. С помощью микротома Thermo Scientific Microm HM 650 готовили срезы толщиной 50 мкм. Экспрессию IRAP, GLUT4 и IL-18 изучали методом непрямой иммуногистохимии для свободно плавающих срезов [19]. После промывки в PBS срезы блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS и 1% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием в течение ночи с первичными антителами к IRAP (Santa Cruz Biotechnology, sc-365300, rabbit monoclonal) 1:1000, GLUT4 (Abcam, ab654, rabbit monoclonal) 1:10000, IL-18 (Santa Cruz, sc-7954, rabbit polyclonal), NeuN (Millipore, ABN78, rabbit polyclonal) 1:1000 с 3% BSA в PBS и 0,2% Triton X-100 при 4 °C. После инкубации с первичными антителами срезы промывали и инкубировали со вторичными антителами Alexa Conjugated antibody в разведении 1:1000 в течение 2 ч при комнатной температуре.

Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Olympus FV 10i. В срезах головного мозга подсчитывали количество клеток нейрональной природы, экспрессирующих маркеры инсулинорезистентности на различных уровнях в гиппокампе (DG) и ольфакторной луковице (OB). Оценивали семь полей зрения для DG и пять полей зрения для OB.

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета анализа программы MS Excel 2010. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое и ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью Т-теста при уровне значимости р<0,05. Все результаты представлены в виде M±m, где М — среднее значение, m — ошибка среднего.

Срезы головного мозга окрашивали по стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуногистохимии для оценки экспрессии IRAP, GLUT4 и IL-18 в клетках нейрональной природы (маркер постмитотических нейронов — NeuN). Все измерения проводились в гранулярном слое клеток зубчатой извилины и ольфакторной луковице. При экспериментальной БА отмечалось значимое увеличение экспрессии IL-18 (p=0,001) в гиппокампе по сравнению с контролем (рис. 1, табл. 1). В ольфакторной луковице наблюдалась тенденция к повышению экспрессии IL-18 у крыс с моделированной нейродегенерацией. Это может свидетельствовать об активации воспалительного процесса за счет сборки внутриклеточных инфламмасом [21].

Несколько иная ситуация наблюдалась в отношении инсулинзависимого глюкозного транспортера GLUT4 (рис. 2, a, б). При Б.А. его экспрессия в гиппокампе (p=0,037) и в ольфакторной луковице (р<0,001) оказалась значимо ниже, чем в контроле (табл. 2). Возможно, это связано со снижением уровня инсулина в клетках головного мозга, наблюдаемое при БА [22], что сопровождается снижением экспрессии GLUT4 [12]. Наши данные подтверждают возникновение инсулинорезистентности при экспериментальной БА [23].

В зубчатой извилине гиппокампа крыс с моделью БА имела место тенденция к увеличению экспрессии IRAP (рис. 3, a, б) в клетках нейрональной природы по сравнению с контролем (p=0,203). Увеличение экспрессии IRAP у подопытных крыс было выявлено также в ольфакторной луковице (табл. 3). Это соответствует нарушению экспрессии GLUT4 при БА [24].

Таким образом, в гиппокампе и ольфакторной луковице животных с экспериментальной БА интенсивность экспрессии инсулинрегулируемой аминопептидазы IRAP и провоспалительного цитокина IL-18 возрастает, тогда как экспрессия инсулинзависимого глюкозного транспортера GLUT4 в данных областях головного мозга снижается.

В мозге больных БА выявлены нейрофибриллярные изменения, потеря нейронов, синаптическая дисфункция как свидетельство эксайтотоксичности, а также выраженный воспалительный процесс. Воспаление играет важную роль в этиопатогенезе БА [25], хотя пока не ясно, является ли оно причиной или вторичным проявлением данного заболевания [26]. Кроме того, остается открытым вопрос о связи воспаления и инсулинорезистентности при нейродегенерации.

Установлено, что резистентность мозга к инсулину возрастает за счет накопления β-амилоида: у пациентов с БА обнаруживается высокая концентрация провоспалительных цитокинов в спинномозговой жидкости [27]. In vivo показано, что воспаление сопровождается образованием и накоплением β-амилоида [21]. β-Амилоид активирует микроглию и астроциты, которые в свою очередь запускают процесс высвобождения провоспалительных цитокинов, ингибирующих рецепторы инсулина за счет увеличения форфорилирования серина IRS-1 (insulin substrate-1) и протеинкиназы В (Akt-киназы), что способствует развитию нейродегенерации [28].

Наши данные [29] о повышении экспрессии провоспалительного цитокина IL-18 на клетках нейрональной природы в гиппокампе и ольфакторной луковице животных с экспериментальной БА могут свидетельствовать о запуске воспалительного процесса и согласуются с результатами исследования экспрессии IL-18 в мозге больных БА.

IL-18 увеличивает экспрессию GSK-3 и циклинзависимой киназы 5 (Cdk5), которые участвуют в гиперфосфорилировании тау-белка [30]. Кроме того, IL-18 может активировать JNK и МАРК р38 сигнальных путей, способствуя запуску апоптоза клеток [31].

Таким образом, IL-18 — один из ключевых медиаторов воспаления и иммунной реакции может играть важную роль в развитии патофизиологических процессов в мозге и способствовать прогрессированию БА.

Доставка глюкозы к клеткам головного мозга осуществляется с помощью глюкозных транспортеров (GLUT). Один из них, инсулинозависимый GLUT4, совместно с рецепторами инсулина в большом количестве экспрессируется в гиппокампе. Инсулин стимулирует экспрессию гена GLUT4 и его транспорт из цитоплазмы к плазматической мембране, тем самым модулируя поглощение и утилизацию глюкозы. Таким образом, инсулин/IGF — сигнальный путь играет ключевую роль в регуляции трансмембранного транспорта глюкозы [12]. Снижение экспрессии GLUT4 в гиппокампе и ольфакторной луковице при БА [32] может быть следствием снижения уровня инсулина в клетках головного мозга [22] и участвовать в нарушении церебрального метаболизма глюкозы.

Выявленная нами тенденция к увеличению экспрессии инсулинрегулируемой аминопептидазы IRAP в клетках нейрональной природы при экспериментальной БА может быть связана с нарушением стимулируемого инсулином транспорта GLUT4 к клеточной мембране, что необходимо для захвата глюкозы клетками мозга [33].

Клинически БА характеризуется прогрессивными нарушениями когнитивных функций и памяти. Показано, что пептиды ангиотензин IV и LVV-геморфин 7, играющие важную роль в процессе обучения и памяти, обладают высоким сродством к IRAP и являются его конкурентными ингибиторами [34]. Высокие концентрации IRAP присутствуют в областях мозга, ответственных за память, а именно в гиппокампе, миндалине и коре [35]. Кроме того, IRAP колоколизован с GLUT4 и регулирует его внутриклеточный транспорт [36].

Известно, что транслокация GLUT4 в мембрану клетки обеспечивается активностью IRAP [37]; отсутствие экспрессии IRAP сопровождается снижением экспрессии и GLUT4 [38]. Поэтому обнаруженное нами несоответствие между экспрессией этих молекул может объясняться отсутствием влияния других инсулинопосредованных [39] или цитоскелет-зависимых [40] механизмов регуляции транспорта GLUT4 в очаге нейровоспаления. В последние годы IRAP считают одним из маркеров инсулинорезистентности при БА. В исследованиях in vivo установлено, что ингибиторы IRAP улучшают память у грызунов [15]. Увеличение экспрессии IRAP и IL-18 в клетках нейрональной природы при нейротоксическом действии β-амилоида соответствует нарушению внутриклеточного транспорта GLUT4 и определяет снижение чувствительности к действию инсулина, что может иметь своим результатом развитие когнитивного дефицита.

Уменьшение экспрессии GLUT4 на фоне увеличения экспрессии IRAP и IL-18 в нейронах головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера свидетельствует о сопряженности механизмов нейровоспаления и инсулинорезистентности, что открывает возможность новых подходов к направленной фармакологической коррекции нейродегенерации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Комлева Ю.К..

Сбор и обработка материала — Горина Я.В., Комлева Ю.К., Лопатина О.Л., Волкова В.В.

Статистическая обработка данных — Герцог Г.Е., Попова Н.Н.

Написание текста — Горина Я.В..

Редактирование — Салмина А.Б..

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Р.Ф. для ведущих научных школ РФ (НШ-1172.2014.7).

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов.