Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Горина К.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Комлева Ю.К.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Лопатина О.Л.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Волкова В.В.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Герцог Г.Е.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Попова Н.Н.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия

Салмина А.Б.

Кафедра биологической химии с курсами медицинской фармацевтической и токсикологической химии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, Красноярск

Особенности экспрессии молекул-маркеров инсулинорезистентности при экспериментальной болезни Альцгеймера

Авторы:

Горина К., Комлева Ю.К., Лопатина О.Л., Волкова В.В., Герцог Г.Е., Попова Н.Н., Салмина А.Б.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2015;61(4): 43‑48

Просмотров: 322

Загрузок: 5

Как цитировать:

Горина К., Комлева Ю.К., Лопатина О.Л., Волкова В.В., Герцог Г.Е., Попова Н.Н., Салмина А.Б. Особенности экспрессии молекул-маркеров инсулинорезистентности при экспериментальной болезни Альцгеймера. Проблемы эндокринологии. 2015;61(4):43‑48.
Gorina YaV, Komleva YuK, Lopatina OL, Volkova VV, Gersog GE, Popova NN, Salmina AB. Features of molecule expression markers of insulin resistance in experimental Alzheimer’s disease. Problemy Endokrinologii. 2015;61(4):43‑48. (In Russ.).
https://doi.org/10.14341/probl201561443-48

?>

По мере старения населения число страдающих деменцией людей, по прогнозам ученых, к 2050 г. возрастет до 115 млн, что, несомненно, создаст значимую проблему для здравоохранения [1]. Клинически заболевание проявляется прогрессирующей потерей памяти и постепенным снижением когнитивных функций [2]. Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется значительной потере нейронов и синапсов, особенно в гиппокампе и коре больших полушарий, внеклеточным накоплением β-амилоида и формированием нейрофибриллярных сплетений [3]. Однако диагноз устанавливается, как правило, на стадии значительного повреждения головного мозга, что существенно снижает эффективность лечения [4]. Большое значение может иметь идентификация молекул-маркеров, позволяющая выявить заболевание на ранних стадиях у людей с высоким риском развития слабоумия.

Результаты недавних исследований свидетельствуют о ключевой роли инсулинорезистентности в развитии когнитивных нарушений и нейродегенерации, в частности при БА [5, 6].

Нарушение передачи сигналов инсулина в головном мозге инициирует сигнальные каскады реакций, включающих ингибирование фосфатидилинозитид-3 киназы (PI3K) и протеинкиназы В (Akt-киназы) и активацию 3β-киназы гликогенсинтазы (GSK-3β), которая индуцирует гиперфосфорилирование тау-белка, накопление Аβ-олигомеров и окислительный стресс, приводящий к митохондриальной дисфункции, апоптозу клеток, секреции провоспалительных цитокинов и нейродегенерации [7].

Кроме того, нарушение эффектов инсулина может вызвать или усилить процессы нейровоспаления, способствующие развитию нейродегенерации [8]. Нейровоспаление характеризуется активацией микроглии и астроцитов, резко возрастающей продукцией провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), формированием внутриклеточных мультибелковых комплексов (инфламмасом), способствующих формированию синаптической и когнитивной дисфункции [9]. Инфламмасомы активируют каспазы 1 и 5, которые запускают секрецию провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-18, IL-33), инициируя нейровоспаление c последующим возникновением когнитивных расстройств и слабоумия [10].

Имеются данные о существенном вкладе инфламмасом в развитие инсулинорезистентности, что предполагает существование связи между формированием инфламмасом в клетках головного мозга и локальной инсулинорезистентностью при нейровоспалении и нейродегенерации [11]. Согласно предложенной гипотезе, нарушение церебрального метаболизма глюкозы, связанное с инсулинорезистентностью, запускает каскад патологических реакций, а именно митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс, эксайтотоксичность, апоптоз, активацию провоспалительных цитокинов, и, следовательно, способствует накоплению β-амилоида и гиперфосфорилированию тау-белка, тем самым вызывая когнитивную дисфункцию и нейродегенерацию [12].

Одним из потенциальных молекул-маркеров инсулинорезистентности является инсулинрегулируемая аминопептидаза (IRAP). Эта цинк-содержащая металлопептидаза обеспечивает протеолиз нейропептидов (в частности, окситоцина и вазопрессина) [13]. Ее ингибирование улучшает память у экспериментальных животных [14]. IRAP участвует в развитии нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с инсулинорезистентностью [15]. Этот фермент колокализован в клетках с инсулинозависимым глюкозным транспортером GLUT4, регулирует его внутриклеточный транспорт и, вероятно, может участвовать в механизме развития инсулинорезистентности, сопряженной с нарушением транслокации GLUT4 к мембране [16].

Таким образом, БА представляет собой, по-видимому, нейроэндокринное расстройство, связанное с мозгоспецифическим нарушением инсулин/IGF-сигнальных механизмов, т. е. «диабет 3-го типа». Однако молекулярный механизм нарушения передачи сигналов инсулина в нейронах остается в значительной степени неизвестным.

Цель настоящей работы — изучение экспрессии молекул-маркеров, а именно, IRAP, GLUT4 и IL-18 в различных областях головного мозга (гиппокамп, обонятельная луковица) у крыс с экспериментальной БА.

Материал и методы

Моделирование нейродегенерации

Крысам опытной группы (10 самцов в возрасте 7 мес) с помощью стереотаксической установки (Narishige, Япония) в СА1 зону гиппокампа с каждой стороны вводили по 5 мкл бета-амилоида 1−42 (Sigma-Aldrich, США). Использовали стереотаксические координаты ML±2,2 мм, АР — 3,0 мм, DV — 2,8 мм. Бета-амилоид 1−42 растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS, Sigma-Aldrich, США) до концентрации 2 мкг/мкл с последующей агрегацией в термостате при 37 °C в течение 7 дней [17]. Контрольную группу составили 10 крыс, которым в те же участки мозга вводили PBS. Животных содержали в клетках со свободным доступом к воде и корму при постоянной температуре 21±1 °С и регулярном световом цикле 12 ч день/12 ч ночь. Эксперименты проводились в соответствии с принципами гуманности, изложенными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/EC).

Оценку признаков БА начинали с 10-х суток после оперативного вмешательства [18].

Иммуногистохимическое исследование

На 14-й день после операции осуществляли транскардиальную перфузию 4% параформальдегидом с последующим забором головного мозга. Мозг фиксировали в 4% нейтральном забуференном формалине, после чего погружали в 20% раствор сахарозы и хранили при +4 °С. С помощью микротома Thermo Scientific Microm HM 650 готовили срезы толщиной 50 мкм. Экспрессию IRAP, GLUT4 и IL-18 изучали методом непрямой иммуногистохимии для свободно плавающих срезов [19]. После промывки в PBS срезы блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS и 1% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием в течение ночи с первичными антителами к IRAP (Santa Cruz Biotechnology, sc-365300, rabbit monoclonal) 1:1000, GLUT4 (Abcam, ab654, rabbit monoclonal) 1:10000, IL-18 (Santa Cruz, sc-7954, rabbit polyclonal), NeuN (Millipore, ABN78, rabbit polyclonal) 1:1000 с 3% BSA в PBS и 0,2% Triton X-100 при 4 °C. После инкубации с первичными антителами срезы промывали и инкубировали со вторичными антителами Alexa Conjugated antibody в разведении 1:1000 в течение 2 ч при комнатной температуре.

Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Olympus FV 10i. В срезах головного мозга подсчитывали количество клеток нейрональной природы, экспрессирующих маркеры инсулинорезистентности на различных уровнях в гиппокампе (DG) и ольфакторной луковице (OB). Оценивали семь полей зрения для DG и пять полей зрения для OB.

Статистический анализ

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета анализа программы MS Excel 2010. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое и ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью Т-теста при уровне значимости р<0,05. Все результаты представлены в виде M±m, где М — среднее значение, m — ошибка среднего.

Результаты

Срезы головного мозга окрашивали по стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуногистохимии для оценки экспрессии IRAP, GLUT4 и IL-18 в клетках нейрональной природы (маркер постмитотических нейронов — NeuN). Все измерения проводились в гранулярном слое клеток зубчатой извилины и ольфакторной луковице. При экспериментальной БА отмечалось значимое увеличение экспрессии IL-18 (p=0,001) в гиппокампе по сравнению с контролем (рис. 1, табл. 1). В ольфакторной луковице наблюдалась тенденция к повышению экспрессии IL-18 у крыс с моделированной нейродегенерацией. Это может свидетельствовать об активации воспалительного процесса за счет сборки внутриклеточных инфламмасом [21].

Таблица 1. Количество клеток (в %), экспрессирующих IL-18 у крыс опытной и контрольной групп

Рис. 1. Экспрессия IL-18 (красный) на нейронах (зеленый) в гиппокампе крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера. Колокализация IL-18 с NeuN (желтый).

Несколько иная ситуация наблюдалась в отношении инсулинзависимого глюкозного транспортера GLUT4 (рис. 2, a, б). При Б.А. его экспрессия в гиппокампе (p=0,037) и в ольфакторной луковице (р<0,001) оказалась значимо ниже, чем в контроле (табл. 2). Возможно, это связано со снижением уровня инсулина в клетках головного мозга, наблюдаемое при БА [22], что сопровождается снижением экспрессии GLUT4 [12]. Наши данные подтверждают возникновение инсулинорезистентности при экспериментальной БА [23].

Таблица 2. Количество клеток (в %), экспрессирующих GLUT4 у крыс опытной и контрольной групп

Рис. 2. (а, б). Экспрессия GLUT4 (красный) на нейронах (зеленый) в гиппокампе крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера. Колокализация GLUT4 с NeuN (желтый).

В зубчатой извилине гиппокампа крыс с моделью БА имела место тенденция к увеличению экспрессии IRAP (рис. 3, a, б) в клетках нейрональной природы по сравнению с контролем (p=0,203). Увеличение экспрессии IRAP у подопытных крыс было выявлено также в ольфакторной луковице (табл. 3). Это соответствует нарушению экспрессии GLUT4 при БА [24].

Таблица 3. Количество клеток (в %), экспрессирующих IRAP у крыс опытной и контрольной групп

Рис. 3. (а, б). Экспрессия IRAP (красный) на нейронах (зеленый) в гиппокампе крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера. Колокализация IRAP с NeuN (желтый).

Таким образом, в гиппокампе и ольфакторной луковице животных с экспериментальной БА интенсивность экспрессии инсулинрегулируемой аминопептидазы IRAP и провоспалительного цитокина IL-18 возрастает, тогда как экспрессия инсулинзависимого глюкозного транспортера GLUT4 в данных областях головного мозга снижается.

Обсуждение

В мозге больных БА выявлены нейрофибриллярные изменения, потеря нейронов, синаптическая дисфункция как свидетельство эксайтотоксичности, а также выраженный воспалительный процесс. Воспаление играет важную роль в этиопатогенезе БА [25], хотя пока не ясно, является ли оно причиной или вторичным проявлением данного заболевания [26]. Кроме того, остается открытым вопрос о связи воспаления и инсулинорезистентности при нейродегенерации.

Установлено, что резистентность мозга к инсулину возрастает за счет накопления β-амилоида: у пациентов с БА обнаруживается высокая концентрация провоспалительных цитокинов в спинномозговой жидкости [27]. In vivo показано, что воспаление сопровождается образованием и накоплением β-амилоида [21]. β-Амилоид активирует микроглию и астроциты, которые в свою очередь запускают процесс высвобождения провоспалительных цитокинов, ингибирующих рецепторы инсулина за счет увеличения форфорилирования серина IRS-1 (insulin substrate-1) и протеинкиназы В (Akt-киназы), что способствует развитию нейродегенерации [28].

Наши данные [29] о повышении экспрессии провоспалительного цитокина IL-18 на клетках нейрональной природы в гиппокампе и ольфакторной луковице животных с экспериментальной БА могут свидетельствовать о запуске воспалительного процесса и согласуются с результатами исследования экспрессии IL-18 в мозге больных БА.

IL-18 увеличивает экспрессию GSK-3 и циклинзависимой киназы 5 (Cdk5), которые участвуют в гиперфосфорилировании тау-белка [30]. Кроме того, IL-18 может активировать JNK и МАРК р38 сигнальных путей, способствуя запуску апоптоза клеток [31].

Таким образом, IL-18 — один из ключевых медиаторов воспаления и иммунной реакции может играть важную роль в развитии патофизиологических процессов в мозге и способствовать прогрессированию БА.

Доставка глюкозы к клеткам головного мозга осуществляется с помощью глюкозных транспортеров (GLUT). Один из них, инсулинозависимый GLUT4, совместно с рецепторами инсулина в большом количестве экспрессируется в гиппокампе. Инсулин стимулирует экспрессию гена GLUT4 и его транспорт из цитоплазмы к плазматической мембране, тем самым модулируя поглощение и утилизацию глюкозы. Таким образом, инсулин/IGF — сигнальный путь играет ключевую роль в регуляции трансмембранного транспорта глюкозы [12]. Снижение экспрессии GLUT4 в гиппокампе и ольфакторной луковице при БА [32] может быть следствием снижения уровня инсулина в клетках головного мозга [22] и участвовать в нарушении церебрального метаболизма глюкозы.

Выявленная нами тенденция к увеличению экспрессии инсулинрегулируемой аминопептидазы IRAP в клетках нейрональной природы при экспериментальной БА может быть связана с нарушением стимулируемого инсулином транспорта GLUT4 к клеточной мембране, что необходимо для захвата глюкозы клетками мозга [33].

Клинически БА характеризуется прогрессивными нарушениями когнитивных функций и памяти. Показано, что пептиды ангиотензин IV и LVV-геморфин 7, играющие важную роль в процессе обучения и памяти, обладают высоким сродством к IRAP и являются его конкурентными ингибиторами [34]. Высокие концентрации IRAP присутствуют в областях мозга, ответственных за память, а именно в гиппокампе, миндалине и коре [35]. Кроме того, IRAP колоколизован с GLUT4 и регулирует его внутриклеточный транспорт [36].

Известно, что транслокация GLUT4 в мембрану клетки обеспечивается активностью IRAP [37]; отсутствие экспрессии IRAP сопровождается снижением экспрессии и GLUT4 [38]. Поэтому обнаруженное нами несоответствие между экспрессией этих молекул может объясняться отсутствием влияния других инсулинопосредованных [39] или цитоскелет-зависимых [40] механизмов регуляции транспорта GLUT4 в очаге нейровоспаления. В последние годы IRAP считают одним из маркеров инсулинорезистентности при БА. В исследованиях in vivo установлено, что ингибиторы IRAP улучшают память у грызунов [15]. Увеличение экспрессии IRAP и IL-18 в клетках нейрональной природы при нейротоксическом действии β-амилоида соответствует нарушению внутриклеточного транспорта GLUT4 и определяет снижение чувствительности к действию инсулина, что может иметь своим результатом развитие когнитивного дефицита.

Заключение

Уменьшение экспрессии GLUT4 на фоне увеличения экспрессии IRAP и IL-18 в нейронах головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера свидетельствует о сопряженности механизмов нейровоспаления и инсулинорезистентности, что открывает возможность новых подходов к направленной фармакологической коррекции нейродегенерации.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Комлева Ю.К..

Сбор и обработка материала — Горина Я.В., Комлева Ю.К., Лопатина О.Л., Волкова В.В.

Статистическая обработка данных — Герцог Г.Е., Попова Н.Н.

Написание текста — Горина Я.В..

Редактирование — Салмина А.Б..

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Р.Ф. для ведущих научных школ РФ (НШ-1172.2014.7).

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail