Распространенность сахарного диабета 2-го типа (СД2) приобрела характер «неинфекционной эпидемии» и, по прогнозам IDF, количество больных с СД2 к 2035 г. должно достичь 592 млн человек. СД2 является фактором риска сердечно-сосудистой патологии, и кардиоваскулярная летальность больных с СД2 в 3-4 раза превышает таковую в общей популяции. Причиной столь выраженного поражения сосудистого русла в настоящее время считают гипергликемию. Метаанализ 20 различных исследований с участием 95 783 пациентов, наблюдавшихся в течение 12 лет, позволил сделать вывод о том, что глюкоза является таким же фактором риска атеросклероза и острой сердечно-сосудистой летальности, что и уровень общего холестерина и артериального давления [1]. Показано, что при сахарном диабете происходит окислительная модификация липопротеинов, в 10-25 раз превышающая контроль [2], в зависимости от уровня гликированного гемоглобина (HbA1c). Макрофаги, захватывая модифицированные ЛПНП посредством скевенжер-рецепторов, накапливают в своей цитоплазме липиды и превращаются в богатые липидами пенистые клетки, которые являются характерным и отличительным признаком атеросклеротического процесса [3].

В последние годы особое внимание уделяется воспалительной теории атерогенеза. Признаки локального и системного неспецифического воспалительного процесса при атеросклерозе прослеживаются с самых ранних стадий поражения стенки сосуда [4, 5]. При атеросклерозе в воспалительный процесс вовлекается несколько типов иммунокомпетентных клеток, прежде всего моноциты, Т- и В-лимфоциты и, возможно, тучные клетки. В процессе атеросклеротического воспаления ключевая роль принадлежит клеткам крови - моноцитам/макрофагам. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, часть которых не трансформируется в пенистые клетки и в дальнейшем секретируют провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α) [6]. Однако существует и альтернативный путь активации макрофагов - М-2, модифицируясь по которому макрофаги приобретают возможность секретировать противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10 и ТФР-β). Такая альтернативная трансформация макрофагов обеспечивает контроль за процессами воспаления при всех хронических воспалительных процессах. Таким образом, развитие атеросклероза может быть связано не только с активацией провоспалительной трансформации макрофагов по классическому пути М-1, но и со снижением активности альтернативного М-2 (противовоспалительный) пути [7]. Гуморальные межклеточные взаимодействия в иммунной системе осуществляются факторами, выделяемыми в кровь активированными клетками (цитокины), среди которых выделяют интерлейкины (факторы взаимодействия между лейкоцитами), интерфероны (цитокины с противовирусной активностью), факторы некроза опухолей (цитокины с цитотоксической активностью), колониестимулирующие факторы, гемопоэтические цитокины. В процесс иммунного воспаления при атеросклерозе вовлекаются все перечисленные группы цитокинов, в связи с чем их также называют маркерами воспаления. Учитывая роль воспаления, при развитии атеросклероза должна наблюдаться поляризация макрофагов по провоспалительному фенотипу. При этом вопрос о поляризации макрофагов при СД2 остается открытым. В связи с этим нами была изучена спонтанная и индуцированная секреция провоспалительного цитокина ФНО-α моноцитами-макрофагами крови больных СД2.

Обследовали 20 пациентов (6 мужчин, 14 женщин) с впервые выявленным СД2, не получавших на момент включения в исследование сахароснижающую терапию; средний возраст пациентов 59 лет (SD 5,9 года), ИМТ - 32 кг/м² (SD 6,5), уровень HbA1c - 8,9% (SD 1,2), гликемия натощак - 10,5 ммоль/л (SD 3,2). Группу сравнения составляли здоровые добровольцы (n=50) без нарушений углеводного обмена, сопоставимые по полу и возрасту. Первичную культуру моноцитов получали из периферической крови. В качестве антикоагулянта использовали раствор цитрата натрия. Из образцов крови отбирали плазму и добавляли в кровь раствор изотонического фосфатного буфера до первоначального объема. Для получения чистой популяции моноцитов проводили магнитную сепарацию положительных к кластеру дифференцировки 14 (CD14+) клеток с использованием парамагнитных наночастиц, конъюгированных с антителами к CD14. Раствор парамагнитных наночастиц добавляли непосредственно к образцу крови в количестве 50 мкл на 10 мл и инкубировали 30 мин. Далее образец наносили на колонку для магнитной сепарации, после чего оставшиеся в колонке CD14-моноциты вымывали из колонки и переносили в культуру. Такой подход позволял получать клеточную популяцию, содержащую не менее 95% моноцитов. Полученные клетки ресуспендировали в концентрации 10⁶ клеток/мл в среде X-vivo 10. Полученную суспензию распределяли в 24-луночный планшет из расчета 1·10⁶ клеток на лунку.

Для стимуляции клеток с целью активации по провоспалительному фенотипу в среду добавляли интерферон-0xE3; (ИФН-0xE3;) в конечной концентрации 100 нг/мл. Инкубацию клеток осуществляли в течение 72 ч при 37 °С в насыщенной парами воды атмосфере в СО2-инкубаторе (95% атмосферного воздуха, 5% углекислого газа) без смены среды. По окончании инкубации культуральную среду отбирали и хранили при –70 °С. Для измерения концентраций ФНО-α в культуральной среде использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета SPSS («SPSS Inc.», США). Достоверными считали различия при p<0,05.

Нестимулированная секреция провоспалительного цитокина ФНО-α культивируемыми моноцитами-макрофагами здоровых лиц составила 270±75 пг/мл культуральной среды. Нестимулированная секреция ФНО-α культивируемыми моноцитами-макрофагами больных CД2 была достоверно в 2,78 раза выше и составила 750±159 пг/мл культуральной среды (p<0,05). Cтимулированная ИФН-0xE3; секреция ФНО-α моноцитами-макрофагами здоровых лиц составила 378±92 пг/мл культуральной среды, а больных СД2 - 1653±341 пг/мл культуральной среды (p<0,05). Таким образом, у здоровых лиц стимуляция культивируемых клеток ИФН-0xE3; привела к 1,4-кратному, а у больных СД2 к 2,2-кратному повышению секреции ФНО-α, различия по способности клеток к стимулированному ответу также имели статистическую значимость (p<0,05).

Считается, что секреция провоспалительного цитокина ФНО-α осуществляется в жировой ткани и отражает развитие воспалительного процесса, усугубляющего инсулинорезистентность за счет подавления активности фосфоинозитол-3-киназы инсулинрецепторного субстрата [8]. Повышение уровня ФНО-α в крови больных СД2 хорошо известно [9-11], однако в доступной литературе нам не удалось найти исследований, доказывающих явную провоспалительную активацию макрофагов у пациентов с СД2. Обладая способностью индуцировать апоптоз, ФНО-α вызывает генерализацию в клеточной мембране активных форм кислорода - супероксид-радикалов, а также оксида азота, усугубляя тем самым окислительный стресс и эндотелиальную дисфункцию. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги при участии многих транскрипционных факторов, среди которых ведущим считается ядерный фактор каппа-В (NF0xEA;B). Активизация NF0xEA;B при СД связана с процессами самоокисления глюкозы по альтернативным путям, развивающимися в результате избыточного образования активных форм кислорода (АФК), приводящих к развитию окислительного стресса [12]. Блокада гликолиза на стадии триозофосфатов повышает образование α-глицеролфосфата - предшественника диацилглицерола, повышающего активность протеинкиназы С (ПКС) [13]. Именно ПКС ответственна за активизацию NF0xEA;B [14], способствующего повышению адгезии моноцитов к сосудистой стенке и их дифференцировке в макрофаги [15] с последующей провоспалительной модификацией.

Данные об усиленной секреции ФНО-α моноцитами-макрофагами больных СД2 позволяют объяснить повышенную концентрацию ФНО-α в крови таких больных. Это может приводить к системному воспалению, усугубляющему ускоренное развитие атеросклероза при данном заболевании. Окислительный стресс, развивающийся в условиях гипергликемии, способствует предатерогенной липидной инфильтрации сосудистой стенки за счет повышения окисляемости липопротеинов с последующим их захватом модифицированными макрофагами [16]. Модификация макрофагов по провоспалительному пути также может способствовать прогрессированию атеросклероза. Усиленная секреция ФНО-α объясняет бурное прогрессирование атеросклероза у больных СД2, обусловленное окислительным стрессом в условиях гипергликемии и самоокисления глюкозы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.А. Собенин, Л.В. Недосугова

Сбор материала - Л.А. Мирзоева

Обработка материала - Н.Г. Никифоров, В.А. Аладинский

Статистическая обработка данных - Л.А. Мирзоева, Н.Г. Никифоров

Написание текста - Л.В. Недосугова

Редактирование - А. Н. Орехов

Конфликт интересов отсутствует.