Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Лохов П.Г.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" РАН

Трифонова О.П.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" РАН

Маслов Д.Л.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" РАН

Балашова Е.Е.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" РАН

Арчаков А.И.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" РАН

Шестакова Е.А.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр", Москва

Шестакова М.В.

Институт диабета Эндокринологического научного центра, Москва

Дедов И.И.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России

Диагностика нарушенной толерантности к глюкозе прямым масс-спектрометрическим анализом метаболитов в плазме крови

Авторы:

Лохов П.Г., Трифонова О.П., Маслов Д.Л., Балашова Е.Е., Арчаков А.И., Шестакова Е.А., Шестакова М.В., Дедов И.И.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2014;60(3): 4‑9

Просмотров: 480

Загрузок: 1

Как цитировать:

Лохов П.Г., Трифонова О.П., Маслов Д.Л., Балашова Е.Е., Арчаков А.И., Шестакова Е.А., Шестакова М.В., Дедов И.И. Диагностика нарушенной толерантности к глюкозе прямым масс-спектрометрическим анализом метаболитов в плазме крови. Проблемы эндокринологии. 2014;60(3):4‑9.
Lokhov PG, Trifonova OP, Maslov DL, Balashova EE, Archakov AI, Shestakova EA, Shestakova MV, Dedov II. Diagnostics of impaired glucose tolerance by the direct mass-spectrometric analysis of plasma metabolites. Problemy Endokrinologii. 2014;60(3):4‑9. (In Russ.).
https://doi.org/10.14341/probl20146034-9

?>

Нарушенная толерантность к глюкозе (НТГ) является состоянием, связанным с повышенным риском развития сахарного диабета (СД) 2-го типа (СД2) [1]. В настоящий момент пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) является золотым стандартом диагностики СД и других нарушений гликемии, в том числе НТГ. Однако этот тест характеризуется низкой воспроизводимостью [2, 3]. Более того, проведение ПГТТ требует времени и подготовки пациента. Таким образом, создание более быстрого и воспроизводимого теста для диагностики НТГ является актуальным.

В данной работе была исследована возможность применения метаболомных методов для диагностики НТГ. В метаболомике большое количество метаболитов может быть определено одномоментно в образце крови, что упрощает диагностику заболеваний [4]. В большинстве случаев метаболомный анализ проводится в несколько стадий [5], применение которых позволяет идентифицировать биомаркеры различных заболеваний, включая метаболиты, указывающие на развитие СД [6]. Среди метаболомных технологий прямой масс-спектрометрический анализ можно считать наиболее приемлемым для применения в клинической диагностике. В данном подходе анализируемый биологический материал непосредственно вносится в источник ионизации масс-спектрометра без какого-либо предварительного разделения входящих в него веществ хроматографическим или иным методом. Таким образом, являясь одностадийным процессом, прямой масс-спектрометрический анализ характеризуется быстротой выполнения и высокой воспроизводимостью и может быть рассмотрен как прототип клинических анализов [5]. Поэтому именно прямой масс-спектрометрический анализ был исследован в данной работе в качестве средства диагностики НТГ.

Материал и методы

В исследовании были использованы образцы крови пациентов, обратившихся в поликлинику ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (Москва). Исследование было одобрено этическим коммитетом данного учреждения. Все пациенты подписали информированное согласие на использование образцов их крови в научных исследованиях. Кровь брали из кубитальной вены утром, натощак, с использованием стекляных вакутейнеров с K2EDTA (BD Vacutainer, США). Биохимический анализ крови (уровень глюкозы, мочевой кислоты, общего холестерина, инсулина, триглицеридов, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП)) проводили на биохимическом анализаторе Architect c4000 («Abbott Diagnostics», США). Гликированный гемоглобин (HbA1c) измеряли анализтором Bio-Rad D10 («Bio-Rad Laboratories», Франция). Глюкозотолерантный тест проводили путем перорального введения пациентам 75 г глюкозы, растворенной в 250 мл воды, и измерения уровня глюкозы в крови через 2 ч. В соответствии с классификацией ВОЗ 2006 г., НТГ диагностировали, если уровень глюкозы плазмы натощак не превышал 6,0 ммоль/л, а через 2 ч находился в диапазоне от 7,8 до 11,0 ммоль/л включительно [7]. Результаты ПГТТ использовали для формирования двух групп: экспериментальной группы пациентов с НТГ (n=20) и контрольной группы лиц без нарушений углеводного обмена (n=30) пациентов. В табл. 1

представлены клинические характеристики обеих групп.

Для масс-спектрометрического анализа использовали плазму крови, полученную центрифугированием образцов крови в течение 15 мин при 1600 g и комнатной температуре. Полученную плазму (10 мкл) смешивали с 10 мкл воды («LiChrosolv», Германия) и 80 мкл метанола («Fluka», Германия) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре для осаждения белка. После чего образцы центрифугировали при 13000 g («MiniSpin plus», Германия) в течение 15 мин. Супернатант разбавляли 50-ю объемами метанола, содержащего 0,1% муравьиной кислоты («Fluka») и анализировали на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре maXis Impact («Bruker Daltonics», США), оборудованном электроспрейным источником ионизации. Масс-спектрометр был настроен на детекцию положительно заряженных ионов в диапазоне m/z 50-1000. Точность измерения составляла 1-3 ppm. Растворы образцов вводили в электроспрейный источник ионизации со скоростью 180 мкл/ч с помощью шприцевого насоса. Порядок анализа образцов был рандомизирован.

Детектируемые в плазме ионы метаболитов, интенсивность которых связана с наличием у пациентов НТГ [с площадью под ROC-кривой (AUC) >0,7)], были использованы для расчета диагностического показателя для ПГТТ, работающего на основе совокупности метаболитов плазмы (далее мб-ПГТТ). С этой целью интенсивность каждого такого метаболита рассматривалась как мера отдельного теста, имеющего два результата на НТГ: положительный, равный «1», и отрицательный, равный «0». Интенсивность пика, соответствующая максимальной точности такого теста, бралась за отсечение между положительным и отрицательным результатом теста. Для расчета диагностического показателя для мб-ПГТТ все положительные результаты, т.е. единицы, суммировались.

Результаты и обсуждение

Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярной фракции плазмы позволил детектировать примерно 4000 ионов метаболитов в одном образце (рис. 1).

Рисунок 1. Протокол метаболомного анализа плазмы, используемый при мб-ПГТТ (а) и масс-спектр, полученный в соответствии с этим протоколом (б). На спектре показаны основные группы детектируемых метаболитов.
При этом интенсивность 230 ионов коррелировала с наличием НТГ у пациента с AUC более 0,7. Так, уровень 103 ионов увеличивался при НТГ, а 127 ионов, наоборот, уменьшался. Величина AUC для мб-ПГТТ составила 0,94 (рис. 2).
Рисунок 2. ROC-кривая для мб-ПГTT. Точка, указанная на ROC-кривой, соответствует максимальной точности мб-ПГТТ. Площадь под ROC-кривой (т.е. AUC) выделена затемнением.

Расчет AUC («Area under ROC-curve» - площадь под ROC-кривой) является общепринятым способом оценки диагностического теста. AUC, равная 0,5-0,6, показывает, что тест не может использоваться для диагностики заболевания; при величине AUC 0,6-0,7 тест имеет низкую диагностическую ценность, 0,7-0,8 - среднюю, а 0,9-1,0 - высокую [8]. AUC для мб-ПГTT, равная 0,94, показывает, что данный тест является высокоэффективным для диагностики НТГ (максимальная точность теста при этом равна 92%). Однако эффективность мб-ПГTT не достигла максимально возможного значения, так как контрольная и экспериментальная группы формировались на основе ПГТТ, который также имеет погрешность.

Следует отметить, что основным недостатком ПГТТ является его низкая воспроизводимость [2, 3]. Уровень глюкозы в крови колеблется в широких пределах, и ее коэффициент вариации (СV - coefficient of variation; процентное соотношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению) в 2-часовом ПГТТ составляет ~25% [2], что и приводит к очень низкой воспроизводимости результатов. Такой высокий CV неприемлем для биоаналитических тестов, где его значение, равное 15%, рассматривается как максимально допустимое [9].

Уровень метаболитов в крови также имеет высокий CV (~45%) [10]. Как следствие, метаболические тесты с применением масс-спектрометрических методов характеризуются очень низкой воспроизводимостью, что мешает их внедрению в клиническую практику [11]. Применение мб-ПГTT, основанного на использовании совокупности связанных с НТГ метаболитов, устраняет этот недостаток. Расчет такого многопараметрического показателя приводит к усреднению ошибки, заложенной в измерении отдельных метаболитов. В результате CV диагностического показателя мб-ПГTT составил всего 7,8%, что существенно ниже показателей СV, допустимых для биоаналитических тестов. Вследствие малого значения CV, измеренная в эксперименте воспроизводимость мб-ПГТТ составила 85% (табл. 2).

Идентификация ионов метаболитов, входящих в мб-ПГTT, является дополнительным подтверждением релевантности данного теста. Идентифицированные метаболиты, уровень которых в крови увеличивается при НТГ с AUC >0,7, представлены в табл. 3

, среди которых как уже известные метаболиты, ответственные за развитие СД, так и ранее не описанные.

Известно, что амиды жирных кислот (эндоканабиоиды), к которым относятся выявленные в исследовании линолеамид, олеамид и стеарамид, играют важную роль в развитии предиабетических нарушений углеводного обмена. Активация эндоканабиоидной системы приводит к увеличению потребления пищи [12] и развитию метаболического синдрома (увеличение индекса массы тела, окружности талии, увеличение в крови уровня инсулина) [13]. Повышенный уровень жирных кислот, который зарегистрирован у пациентов с НТГ, также подтверждается ранее полученными данными. Так, метаболический синдром характеризуется повышенным уровнем липидов [14], в том числе и жирных кислот [15].

Фосфатидилхолин, включающий в свой состав углеродные цепи олеиновой и миристиновой кислот, был также увеличен в крови пациентов с НТГ. Данный факт может являться отражением метаболического синдрома, связанного с НТГ и характеризующегося липидными нарушениями.

Децендикислота относится к дикарбоновым кислотам, увеличение экскреции которых с мочой зарегистрировано у пациентов с СД2, и которые рассматриваются как маркеры окислительного воздействия на жирные кислоты [16]. Увеличенный уровень в крови децендикислоты в нашем исследовании может указывать на наличие подобного окислительного воздействия на жирные кислоты при НТГ. Однако для подтверждения этого требуются дальнейшие исследования.

α-Кетооктановая кислота - кетокислота с разветвленным углеродным радикалом, является интермедиатом в катаболизме лейцина. Недавно было установлено, что лейцин и другие аминокислоты с разветвленной углеродной цепью являются биомаркерами риска развития СД [6]. β-Кетооктановая кислота - жирная кислота, которая образуется из малонил-коэнзима. Высокий уровень β-кетооктановой кислоты был установлен у пациентов с избыточным весом и СД2 [17]. Таким образом, одна из двух, а возможно и обе кетооктановые кислоты вносят вклад в мб-ПГТТ (используемый метод идентификации метаболитов не позволяет различить α- и β-кетокислоты).

П-крезол сульфат - метаболит микробов и вторичный метаболит п-крезола. Известно, что больные с СД имеют высокую концентрацию как свободного, так и общего п-крезола в крови [18].

Орнитин - аминокислота, произведенная в мочевом цикле. Уровень орнитина в плазме крови повышен у пациентов с СД2 в результате пониженной активности аргиназы [19].

Фосфогликолевая кислота является субстратом для триозофосфат изомеразы. В литературе нет данных о повышении ее уровня при НГТ у пациентов.

Среди метаболитов, характеризующихся низким уровнем при НТГ, изменение уровня ионов калия вносило основной вклад. Ранее было показано, что калий понижен при диабетическом кетоацидозе [20]. Точнее, в организме происходит интенсивное выведение положительно заряженных ионов калия через почки, ввиду выделения ими в кровь отрицательно заряженных кетонов, представленных также и при НТГ. Таким образом, зарегистрированное снижение ионов калия подтверждается ранее установленными данными.

Идентификация других метаболитов, также характеризующихся низким уровнем при НТГ, осложнена вследствие некоторых особенностей используемого метода ионизации. Ионизация электроспреем отличается возможностью образования анализируемыми веществами квазиионов, в том числе и с калием. В данном исследовании у пациентов с НТГ уровень калия значительно менялся и, как следствие, менялся уровень образующихся калийсодержащих квазиионов. Поэтому для анализа метаболитов крови, характеризующихся низким уровнем при НТГ, необходимо дополнительное исследование с использованием других методов ионизации.

Заключение

Выявленные в результате прямого масс-спектрометрического анализа ионы метаболитов, уровень которых в плазме связан с наличием у пациентов НТГ, позволили создать мб-ПГТТ (т.е. ПГТТ, работающий на основе метаболомного анализа крови), обладающий высокой точностью диагностики. Идентификация выявленных в исследовании метаболитов подтвердила, что мб-ПГТТ основан на метаболической картине крови, отражающей развитие СД у пациента. Дальнейшие исследования мб-ПГТТ на более крупных выборках помогут более полно охарактеризовать эффективность теста, однако уже сейчас данный тест можно рассматривать как более воспроизводимую и быструю альтернативу используемому в клинике ПГТТ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.И. Дедов, А.И. Арчаков, М.В. Шестакова, П.Г. Лохов

Сбор и обработка материала - Е.А. Шестакова, О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, Е.Е. Балашова

Статистическая обработка данных - П.Г. Лохов

Написание текста - П.Г. Лохов

Редактирование - И.И. Дедов, А.И. Арчаков, М.В. Шестакова

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Литература

  1. Tabák A.G., Herder C., Rathmann W., Brunner E.J., Kivimäki M. Prediabetes: a high-risk state for diabetes development. Lancet 2012; 379: 9833: 2279-2290. doi: 10.1016/s0140-6736(12)60283-9.
  2. Mcdonald G.W., Fisher G.F., Burnham C. Reproducibility of the oral glucose tolerance test. Diabetes 1965; 14: 473-480.
  3. Ko G.T.C., Chan J.C.N., Woo J., Lau E., Yeung V.T.F., Chow C.C. et al. The Reproducibility and Usefulness of the Oral Glucose Tolerance Test in Screening for Diabetes and other Cardiovascular Risk Factors. Annals of Clinical Biochemistry. Intern J Biochem Labor Med 1998; 35: 1: 62-67. doi: 10.1177/000456329803500107.
  4. Gowda G.A.N., Zhang S., Gu H., Asiago V., Shanaiah N., Raftery D. Metabolomics-based methods for early disease diagnostics. Exp Rev Mol Diagn 2008; 8: 5: 617-633. doi: 10.1586/14737159.8.5.617.
  5. Dettmer K., Aronov P.A., Hammock B.D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectr Rev 2007; 26: 1: 51-78. doi: 10.1002/mas.20108.
  6. Wang T.J., Larson M.G., Vasan R.S. et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature Med 2011; 17: 4: 448-453. doi: 10.1038/nm.2307.
  7. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia. Report of a WHO/IDF. Consultation 2006.
  8. Metz C.E. Basic principles of ROC analysis. Semin Nucl Med 1978; 8: 4: 283-298. doi: 10.1016/s0001-2998(78)80014-2.
  9. US Department of Health and Human Services, FDA, CDER, C. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 2001.
  10. Crews B., Wikoff W.R., Patti G.J., Woo H.-K., Kalisiak E., Heideker J. et al. Variability Analysis of Human Plasma and Cerebral Spinal Fluid Reveals Statistical Significance of Changes in Mass Spectrometry-Based Metabolomics Data. Anal Chem 2009; 81: 20: 8538-8544. doi: 10.1021/ac9014947.
  11. Strathmann F.G., Hoofnagle A.N. Current and Future Applications of Mass Spectrometry to the Clinical Laboratory. Am J Clin Pathol 2011; 136: 4: 609-616. doi: 10.1309/ajcpw0ta8obbngck.
  12. Engeli S., Bohnke J., Feldpausch M., Gorzelniak K., Janke J., Batkai S. et al. Activation of the Peripheral Endocannabinoid System in Human Obesity. Diabetes 2005; 54: 10: 2838-2843. doi: 10.2337/diabetes.54.10.2838.
  13. Sipe J.C., Waalen J., Gerber A., Beutler E. Overweight and obesity associated with a missense polymorphism in fatty acid amide hydrolase (FAAH). Intern J Obes 2005; 29: 7: 755-759. doi: 10.1038/sj.ijo.0802954.
  14. Fonseca V.A. The metabolic syndrome,hyperlipidemia, and insulin resistance. Clin Cornerstone 2005; 7: 2-3: 61-72. doi: 10.1016/s1098-3597(05)80069-9.
  15. Breant B., Suhre K., Meisinger C., Döring A., Altmaier E., Belcredi P. et al. Metabolic Footprint of Diabetes: A Multiplatform Metabolomics Study in an Epidemiological Setting. PloS One 2010; 5: 11: e13953. doi: 10.1371/journal.pone.0013953.
  16. Inouye M., Mio T., Sumino K. Dicarboxylic acids as markers of fatty acid peroxidation in diabetes. Atherosclerosis 2000; 148: 1: 197-202. doi: 10.1016/s0021-9150(99)00263-4.
  17. Bandyopadhyay G.K. Increased Malonyl-CoA Levels in Muscle From Obese and Type 2 Diabetic Subjects Lead to Decreased Fatty Acid Oxidation and Increased Lipogenesis; Thiazolidinedione Treatment Reverses These Defects. Diabetes 2006; 55: 8: 2277-2285. doi: 10.2337/db06-0062.
  18. Meijers B.K.I., Bammens B., De Moor B., Verbeke K., Vanrenterghem Y., Evenepoel P. Free p-cresol is associated with cardiovascular disease in hemodialysis patients. Kidney Intern 2008; 73: 10: 1174-1180. doi: 10.1038/ki.2008.31.
  19. Kashyap S.R., Lara A., Zhang R., Park Y.M., DeFronzo R.A. Insulin Reduces Plasma Arginase Activity in Type 2 Diabetic Patients. Diabetes Care 2007; 31: 1: 134-139. doi: 10.2337/dc07-1198.
  20. Kitabchi A.E., Umpierrez G.E., Miles J.M., Fisher J.N. Hyperglycemic Crises in Adult Patients With Diabetes. Diabetes Care 2009; 32: 7: 1335-1343. doi: 10.2337/dc09-9032.
!!

Литература

  1. Tabák A.G., Herder C., Rathmann W., Brunner E.J., Kivimäki M. Prediabetes: a high-risk state for diabetes development. Lancet 2012; 379: 9833: 2279-2290. doi: 10.1016/s0140-6736(12)60283-9.
  2. Mcdonald G.W., Fisher G.F., Burnham C. Reproducibility of the oral glucose tolerance test. Diabetes 1965; 14: 473-480.
  3. Ko G.T.C., Chan J.C.N., Woo J., Lau E., Yeung V.T.F., Chow C.C. et al. The Reproducibility and Usefulness of the Oral Glucose Tolerance Test in Screening for Diabetes and other Cardiovascular Risk Factors. Annals of Clinical Biochemistry. Intern J Biochem Labor Med 1998; 35: 1: 62-67. doi: 10.1177/000456329803500107.
  4. Gowda G.A.N., Zhang S., Gu H., Asiago V., Shanaiah N., Raftery D. Metabolomics-based methods for early disease diagnostics. Exp Rev Mol Diagn 2008; 8: 5: 617-633. doi: 10.1586/14737159.8.5.617.
  5. Dettmer K., Aronov P.A., Hammock B.D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectr Rev 2007; 26: 1: 51-78. doi: 10.1002/mas.20108.
  6. Wang T.J., Larson M.G., Vasan R.S. et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature Med 2011; 17: 4: 448-453. doi: 10.1038/nm.2307.
  7. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia. Report of a WHO/IDF. Consultation 2006.
  8. Metz C.E. Basic principles of ROC analysis. Semin Nucl Med 1978; 8: 4: 283-298. doi: 10.1016/s0001-2998(78)80014-2.
  9. US Department of Health and Human Services, FDA, CDER, C. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 2001.
  10. Crews B., Wikoff W.R., Patti G.J., Woo H.-K., Kalisiak E., Heideker J. et al. Variability Analysis of Human Plasma and Cerebral Spinal Fluid Reveals Statistical Significance of Changes in Mass Spectrometry-Based Metabolomics Data. Anal Chem 2009; 81: 20: 8538-8544. doi: 10.1021/ac9014947.
  11. Strathmann F.G., Hoofnagle A.N. Current and Future Applications of Mass Spectrometry to the Clinical Laboratory. Am J Clin Pathol 2011; 136: 4: 609-616. doi: 10.1309/ajcpw0ta8obbngck.
  12. Engeli S., Bohnke J., Feldpausch M., Gorzelniak K., Janke J., Batkai S. et al. Activation of the Peripheral Endocannabinoid System in Human Obesity. Diabetes 2005; 54: 10: 2838-2843. doi: 10.2337/diabetes.54.10.2838.
  13. Sipe J.C., Waalen J., Gerber A., Beutler E. Overweight and obesity associated with a missense polymorphism in fatty acid amide hydrolase (FAAH). Intern J Obes 2005; 29: 7: 755-759. doi: 10.1038/sj.ijo.0802954.
  14. Fonseca V.A. The metabolic syndrome,hyperlipidemia, and insulin resistance. Clin Cornerstone 2005; 7: 2-3: 61-72. doi: 10.1016/s1098-3597(05)80069-9.
  15. Breant B., Suhre K., Meisinger C., Döring A., Altmaier E., Belcredi P. et al. Metabolic Footprint of Diabetes: A Multiplatform Metabolomics Study in an Epidemiological Setting. PloS One 2010; 5: 11: e13953. doi: 10.1371/journal.pone.0013953.
  16. Inouye M., Mio T., Sumino K. Dicarboxylic acids as markers of fatty acid peroxidation in diabetes. Atherosclerosis 2000; 148: 1: 197-202. doi: 10.1016/s0021-9150(99)00263-4.
  17. Bandyopadhyay G.K. Increased Malonyl-CoA Levels in Muscle From Obese and Type 2 Diabetic Subjects Lead to Decreased Fatty Acid Oxidation and Increased Lipogenesis; Thiazolidinedione Treatment Reverses These Defects. Diabetes 2006; 55: 8: 2277-2285. doi: 10.2337/db06-0062.
  18. Meijers B.K.I., Bammens B., De Moor B., Verbeke K., Vanrenterghem Y., Evenepoel P. Free p-cresol is associated with cardiovascular disease in hemodialysis patients. Kidney Intern 2008; 73: 10: 1174-1180. doi: 10.1038/ki.2008.31.
  19. Kashyap S.R., Lara A., Zhang R., Park Y.M., DeFronzo R.A. Insulin Reduces Plasma Arginase Activity in Type 2 Diabetic Patients. Diabetes Care 2007; 31: 1: 134-139. doi: 10.2337/dc07-1198.
  20. Kitabchi A.E., Umpierrez G.E., Miles J.M., Fisher J.N. Hyperglycemic Crises in Adult Patients With Diabetes. Diabetes Care 2009; 32: 7: 1335-1343. doi: 10.2337/dc09-9032.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail