Регуляция аденилатциклазной сигнальной системы пептидами инсулинового семейства, эпидермальным фактором роста, лептином и ее функциональные нарушения в лимфоцитах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа

Инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) и релаксин — пептиды инсулинового семейства, имеющие структурно-функциональное сходство. Инсулин контролирует углеводный и липидный метаболизм; ИФР-1 оказывает преимущественно ростстимулирующий эффект, а также регулирует глюкозный гомеостаз и применяется при лечении сахарного диабета (СД) [1]. Релаксин, функционально близкий к инсулину, регулирует у позвоночных репродуктивную систему, и его уровень положительно коррелирует с чувствительностью организма к инсулину, особенно при СД 2-го типа (СД2) [2]. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) стимулирует клеточную пролиферацию с участием аденилатциклазы (АЦ) и цАМФ-зависимого механизма [3]. Лептин, продуцируемый адипоцитами, обладает широким спектром действия, включая регуляцию энергетического баланса, метаболизма глюкозы и функции инсулина [4].

Регуляция пептидами инсулинового семейства аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) при СД2, за исключением наших работ, не изучена, а влияние лептина на АЦСС практически не исследовалось ни в норме, ни при СД2 [5—7]. Установлено, что активирующий АЦСС эффект инсулина и ИФР-1 реализуется через следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа → ингибирующий ГТФ-связывающий белок (G_i, β_γ-димер) → фосфатидилинозитол 3-киназа → протеинкиназа С ζ (дзета) → стимулирующий ГТФ-связывающий белок (G_s) → АЦ [5, 6, 8]. Согласно развиваемой нами концепции, АЦСС участвует в регуляции пептидами инсулиновой природы основных процессов в клетке (метаболизм, клеточный рост, апоптоз, расслабление гладких мышц) [9].

СД2 можно считать «семейной» формой болезни, связанной с ожирением и являющейся причиной целого ряда функциональных нарушений. Патогенез заболевания сложен и полностью не выяснен. Наша лаборатория в течение ряда лет занимается изучением молекулярных дефектов в АЦСС при СД2 у человека, а также на крысиных моделях [10, 11]. Согласно современной точке зрения, при СД2 функции почти всех отделов эндокринной системы нарушены [12]. Нарушения функций инсулиновой системы подтверждаются результатами исследований, которые выявили молекулярные дефекты регуляторных функций не только инсулина, но и родственных пептидов (ИФР-1, релаксин) на уровне АЦСС [10, 13]. Совокупность имеющихся к настоящему времени данных привели нас к выводу о полигормональном генезе сахарного диабета [11, 14].

Представления о патогенезе СД2 значительно расширяются благодаря исследованиям, проводимым на клеточном уровне. Объектом подобных исследований, как правило, служат клетки крови, в том числе лимфоциты. Лимфоциты играют важную роль при развитии целого ряда заболеваний, для которых характерны иммунорегуляторные взаимодействия и процессы иммуноаллергического воспаления. К таким заболеваниям можно отнести бронхиальную астму, СД2, инсулиновую и лептиновую резистентность, ожирение и др. Особый интерес к этим клеткам можно объяснить: 1) полноценностью метаболизма, что дает основания говорить о лимфоците как о своеобразном ферментном «зеркале» многих тканей; 2) присутствием в лимфоцитах АЦСС, чувствительной к целому ряду гормонов; 3) высокой жизнеспособностью лимфоцитов и наличием доступных методов получения достаточного количества этих клеток; 4) обнаружением нарушения функций ферментных систем лимфоцитов, что является одним из звеньев в развитии патогенеза СД2 [15, 16]. Цель работы состояла в исследовании функционального состояния механизмов передачи гормональных сигналов, реализуемых через АЦСС в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2.

В исследовании участвовали пациенты контрольной группы и больные со средне-тяжелой формой СД2. Диагноз устанавливали на основании клинических проявлений болезни и данных лабораторного исследования (табл. 1).

Лимфоциты получали методом центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографин. После градиента обогащенную общую популяцию лимфоцитов отмывали центрифугированием в буфере для определения активности АЦ.

Активность АЦ определяли по методу [10] в реакционной смеси (конечный объем 50 мкл, мМ): 25 трис-HCl (pH 7,5), 5 MgCl₂, 0,1 ATФ, 1 цAMФ, 20 креатинфосфата, 1 мкКи [α-³²P]ATФ, 0,2 мкг/мл креатинфосфокиназы и 15—20 мкг мембранного белка, при 37 °C в течение 3 мин при действии гормонов и 10 мин при влиянии негормональных агентов. Активность АЦ оценивали по количеству образовавшегося цАМФ и выражали в пикомолях цАМФ/мг белка/мин. Каждый эксперимент выполнен 2 раза в 4 параллельных пробах.

Для определения функции отдельных компонентов АЦСС использовали комплекс функциональных тестов. При действии форсколина выявлялась функция каталитического компонента АЦ. Использование фторида натрия и гуанинового нуклеотида гуанилилимидодифосфата (ГИДФ) позволяло оценить участие ГТФ-связывающих G-белков. Влияние пептидов (10^-8 М) на активность АЦ выявлялось при коротком сроке действия — 3 мин. О сопряжении между компонентами АЦСС судили по потенцированию (усилению) эффекта ГИДФ при действии исследуемых пептидов на АЦ.

Антитела к рецепторам лептина добавляли к пробам с мембранами лимфоцитов и преинкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре при перемешивании, затем вносили гормон и определяли активность АЦ. Контролем служили пробы с 25 мМ трис-НС1, рН 7,4. Содержание белка определяли методом Лоури.

Все данные представлены в виде средней ± cтандартная ошибка средней (М±m). Различия в пределах контрольной группы при действии пептидов и между контрольной и диабетической группами были статистически обработаны с использованием программы ANOVA и считались достоверными при р<0,05.

В работе использованы реактивы: креатинфосфат, креатинфосфокиназа (3500 Ед/мг белка), ГИДФ, форсколин, трис-НСl, окись алюминия для колоночной хроматографии, АТФ, цАМФ, имидазол, кристаллический инсулин человека, ЭФР, ИФР-1 и лептин от фирмы «Sigma» (США). Кристаллический релаксин 2 человека был любезно предоставлен доктором J. Wide (Австралия). Антитела к рецепторам лептина (мышь) в разведении 1:1000 («Sigma — Aldrich», США). α-[³²Р]АТФ (4 Ки/ммоль) от фирмы «Изотоп» (Россия).

Исследование АЦСС мембран лимфоцитов контрольной группы пациентов показало, что негормональные агенты форсколин, фторид натрия и ГИДФ (табл. 2),

У пациентов с СД2 обнаружено увеличение базальной активности АЦ, что свидетельствует о повышенной каталитической функции фермента. Повышение каталитической способности АЦ при СД2 может происходить за счет влияния гипергликемии, как было показано ранее [16]. Наряду с этим выявлено снижение стимулирующего влияния фторида натрия на АЦСС при сопряжении с G_s-белком (см. табл. 2). Эффекты форсколина и ГИДФ не изменялись. У пациентов с СД2 снижалось стимулирующее действие исследованных пептидов, а потенцирование их эффектов в присутствии ГИДФ практически отсутствовало (см. рис. 1).

Лептин in vitro (3 мин) достоверно стимулировал активность АЦ при концентрациях 10^-11—10^-8 М в мембранах лимфоцитов контрольных испытуемых (рис. 2).

Таким образом, при СД2 наблюдаются изменения в регуляции АЦ: на фоне возрастания базальной активности фермента влияния изученных гормонов инсулинового семейства, ЭФР и лептина, а также фторида натрия на АЦСС ослабевают. Эти данные свидетельствуют о нарушении АЦ-стимулирующего действия как негормонального агента (фторида натрия), так и гормонов не только инсулиновой группы, но и лептина и ЭФР. Полученные результаты могут служить подтверждением нашей гипотезы о системном ответе эндокринной системы организма на дефекты в функционировании АЦСС при действии гормонов различной природы и полигормональном генезе молекулярных дефектов в АЦСС. Можно предположить, что нарушения в АЦ-стимуляции гормонами возникают как на рецепторных (что видно на примере лептина), так и на пострецепторных этапах передачи сигналов через АЦСС, и конкретно — на этапе взаимодействия G_s-белка и АЦ. Снижение функции G_s-белка при нарушении гормональной стимуляции АЦ подкрепляют данные о том, что чувствительность фермента к фториду натрия также снижается.

1. Впервые показано стимулирующее влияние пептидов инсулинового семейства, ЭФР и лептина на активность АЦ в лимфоцитах человека.

2. При СД2 в лимфоцитах человека увеличивается базальная активность АЦ и снижается чувствительность АЦСС к фториду натрия, пептидам инсулинового семейства, ЭФР и лептину. Нарушения гормональной регуляции активности АЦ при СД2 связаны с функциональными дефектами, локализованными в случае лептина на рецепторном уровне, а в случае пептидов инсулинового семейства и ЭФР, скорее всего, на уровне G_s-белка и его сопряжения с АЦ.

Работа поддержана грантами: РФФИ 10-04-01052 и «Фундаментальные науки — медицине», 2011 г. Благодарим Е.А. Манову, к.м.н., врача-эндокринолога Клинической больницы РАН, Санкт-Петербург, за подбор больных и помощь в получении экспериментального материала.