Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Кузнецова Л.А.

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Плеснева С.А.

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Чистякова О.В.

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Шарова Т.С.

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Перцева М.Н.

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Регуляция аденилатциклазной сигнальной системы пептидами инсулинового семейства, эпидермальным фактором роста, лептином и ее функциональные нарушения в лимфоцитах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа

Авторы:

Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Чистякова О.В., Шарова Т.С., Перцева М.Н.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2011;57(4): 32‑36

Просмотров : 244

Загрузок: 4

Как цитировать:

Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Чистякова О.В., Шарова Т.С., Перцева М.Н. Регуляция аденилатциклазной сигнальной системы пептидами инсулинового семейства, эпидермальным фактором роста, лептином и ее функциональные нарушения в лимфоцитах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа. Проблемы эндокринологии. 2011;57(4):32‑36.
Kuznetsova LA, Plesneva SA, Chistiakova OV, Sharova TS, Pertseva MN. Regulation of the adenilate cyclase signal system by peptides of the insulin family, epidermal growth factor, and leptin and its functional disturbances in lymphocytes from patients presenting with type 2 diabetes mellitus. Problemy Endokrinologii. 2011;57(4):32‑36. (In Russ.).

Инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) и релаксин — пептиды инсулинового семейства, имеющие структурно-функциональное сходство. Инсулин контролирует углеводный и липидный метаболизм; ИФР-1 оказывает преимущественно ростстимулирующий эффект, а также регулирует глюкозный гомеостаз и применяется при лечении сахарного диабета (СД) [1]. Релаксин, функционально близкий к инсулину, регулирует у позвоночных репродуктивную систему, и его уровень положительно коррелирует с чувствительностью организма к инсулину, особенно при СД 2-го типа (СД2) [2]. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) стимулирует клеточную пролиферацию с участием аденилатциклазы (АЦ) и цАМФ-зависимого механизма [3]. Лептин, продуцируемый адипоцитами, обладает широким спектром действия, включая регуляцию энергетического баланса, метаболизма глюкозы и функции инсулина [4].

Регуляция пептидами инсулинового семейства аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) при СД2, за исключением наших работ, не изучена, а влияние лептина на АЦСС практически не исследовалось ни в норме, ни при СД2 [5—7]. Установлено, что активирующий АЦСС эффект инсулина и ИФР-1 реализуется через следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа → ингибирующий ГТФ-связывающий белок (Gi, βγ-димер) → фосфатидилинозитол 3-киназа → протеинкиназа С ζ (дзета) → стимулирующий ГТФ-связывающий белок (Gs) → АЦ [5, 6, 8]. Согласно развиваемой нами концепции, АЦСС участвует в регуляции пептидами инсулиновой природы основных процессов в клетке (метаболизм, клеточный рост, апоптоз, расслабление гладких мышц) [9].

СД2 можно считать «семейной» формой болезни, связанной с ожирением и являющейся причиной целого ряда функциональных нарушений. Патогенез заболевания сложен и полностью не выяснен. Наша лаборатория в течение ряда лет занимается изучением молекулярных дефектов в АЦСС при СД2 у человека, а также на крысиных моделях [10, 11]. Согласно современной точке зрения, при СД2 функции почти всех отделов эндокринной системы нарушены [12]. Нарушения функций инсулиновой системы подтверждаются результатами исследований, которые выявили молекулярные дефекты регуляторных функций не только инсулина, но и родственных пептидов (ИФР-1, релаксин) на уровне АЦСС [10, 13]. Совокупность имеющихся к настоящему времени данных привели нас к выводу о полигормональном генезе сахарного диабета [11, 14].

Представления о патогенезе СД2 значительно расширяются благодаря исследованиям, проводимым на клеточном уровне. Объектом подобных исследований, как правило, служат клетки крови, в том числе лимфоциты. Лимфоциты играют важную роль при развитии целого ряда заболеваний, для которых характерны иммунорегуляторные взаимодействия и процессы иммуноаллергического воспаления. К таким заболеваниям можно отнести бронхиальную астму, СД2, инсулиновую и лептиновую резистентность, ожирение и др. Особый интерес к этим клеткам можно объяснить: 1) полноценностью метаболизма, что дает основания говорить о лимфоците как о своеобразном ферментном «зеркале» многих тканей; 2) присутствием в лимфоцитах АЦСС, чувствительной к целому ряду гормонов; 3) высокой жизнеспособностью лимфоцитов и наличием доступных методов получения достаточного количества этих клеток; 4) обнаружением нарушения функций ферментных систем лимфоцитов, что является одним из звеньев в развитии патогенеза СД2 [15, 16]. Цель работы состояла в исследовании функционального состояния механизмов передачи гормональных сигналов, реализуемых через АЦСС в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2.

Материал и методы

В исследовании участвовали пациенты контрольной группы и больные со средне-тяжелой формой СД2. Диагноз устанавливали на основании клинических проявлений болезни и данных лабораторного исследования (табл. 1).

Лимфоциты получали методом центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографин. После градиента обогащенную общую популяцию лимфоцитов отмывали центрифугированием в буфере для определения активности АЦ.

Активность АЦ определяли по методу [10] в реакционной смеси (конечный объем 50 мкл, мМ): 25 трис-HCl (pH 7,5), 5 MgCl2, 0,1 ATФ, 1 цAMФ, 20 креатинфосфата, 1 мкКи [α-32P]ATФ, 0,2 мкг/мл креатинфосфокиназы и 15—20 мкг мембранного белка, при 37 °C в течение 3 мин при действии гормонов и 10 мин при влиянии негормональных агентов. Активность АЦ оценивали по количеству образовавшегося цАМФ и выражали в пикомолях цАМФ/мг белка/мин. Каждый эксперимент выполнен 2 раза в 4 параллельных пробах.

Для определения функции отдельных компонентов АЦСС использовали комплекс функциональных тестов. При действии форсколина выявлялась функция каталитического компонента АЦ. Использование фторида натрия и гуанинового нуклеотида гуанилилимидодифосфата (ГИДФ) позволяло оценить участие ГТФ-связывающих G-белков. Влияние пептидов (10-8 М) на активность АЦ выявлялось при коротком сроке действия — 3 мин. О сопряжении между компонентами АЦСС судили по потенцированию (усилению) эффекта ГИДФ при действии исследуемых пептидов на АЦ.

Антитела к рецепторам лептина добавляли к пробам с мембранами лимфоцитов и преинкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре при перемешивании, затем вносили гормон и определяли активность АЦ. Контролем служили пробы с 25 мМ трис-НС1, рН 7,4. Содержание белка определяли методом Лоури.

Все данные представлены в виде средней ± cтандартная ошибка средней (М±m). Различия в пределах контрольной группы при действии пептидов и между контрольной и диабетической группами были статистически обработаны с использованием программы ANOVA и считались достоверными при р<0,05.

В работе использованы реактивы: креатинфосфат, креатинфосфокиназа (3500 Ед/мг белка), ГИДФ, форсколин, трис-НСl, окись алюминия для колоночной хроматографии, АТФ, цАМФ, имидазол, кристаллический инсулин человека, ЭФР, ИФР-1 и лептин от фирмы «Sigma» (США). Кристаллический релаксин 2 человека был любезно предоставлен доктором J. Wide (Австралия). Антитела к рецепторам лептина (мышь) в разведении 1:1000 («Sigma — Aldrich», США). α-[32Р]АТФ (4 Ки/ммоль) от фирмы «Изотоп» (Россия).

Результаты и обсуждение

Исследование АЦСС мембран лимфоцитов контрольной группы пациентов показало, что негормональные агенты форсколин, фторид натрия и ГИДФ (табл. 2),

а также пептиды — инсулин, ИФР-1, релаксин и ЭФР (рис. 1),
Рисунок 1. Влияние in vitro пептидов инсулинового семейства и ЭФР, а также совместно пептидов и ГИДФ на активность АЦ в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2. По вертикали: % стимуляции фермента, рассчитанный по разности между стимулированной и базальной активностью АЦ в контроле и при СД2. По горизонтали: влияние агентов, М: 1 — ГИДФ, 10–6; 2 — инсулин, 10–8; 3 — ИФР-1, 10–8; 4 — релаксин, 10–8; 5 — ЭФР, 10–8; 6 — инсулин + ГИДФ; 7 — ИФР-1 + ГИДФ; 8 — релаксин +ГИДФ; 9 — ЭФР + ГИДФ. * — достоверные отличия активности АЦ при СД2 от контрольных величин. Величина базальной активности АЦ в лимфоцитах составляла у контрольной группы лиц и пациентов с СД2 13,0±1,4 и 30,2±5,3 пикомолей цАМФ /мг белка/мин соответственно.
оказывают стимулирующее влияние на активность АЦ. Эффект пептидов усиливался в присутствии ГИДФ.

У пациентов с СД2 обнаружено увеличение базальной активности АЦ, что свидетельствует о повышенной каталитической функции фермента. Повышение каталитической способности АЦ при СД2 может происходить за счет влияния гипергликемии, как было показано ранее [16]. Наряду с этим выявлено снижение стимулирующего влияния фторида натрия на АЦСС при сопряжении с Gs-белком (см. табл. 2). Эффекты форсколина и ГИДФ не изменялись. У пациентов с СД2 снижалось стимулирующее действие исследованных пептидов, а потенцирование их эффектов в присутствии ГИДФ практически отсутствовало (см. рис. 1).

Лептин in vitro (3 мин) достоверно стимулировал активность АЦ при концентрациях 10-11—10-8 М в мембранах лимфоцитов контрольных испытуемых (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние in vitro антител к рецептору лептина на стимуляцию лептином активности АЦ в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2. 1 — контроль; 2 — СД2; 3 — контроль+антитела; 4 — СД2+антитела. По вертикали: % стимуляции фермента, рассчитанный по разности между стимулированной и базальной активностью АЦ в контроле и при СД2. * — достоверные отличия активности АЦ при СД2 от контрольных величин; # — достоверное влияние антител на активность АЦ в контроле и при СД2.
Для доказательства участия рецепторов лептина в стимуляции АЦ были применены специфические антитела. Обработка мембран антителами вызывала отчетливое подавление стимуляции АЦ лептином. Представленные данные свидетельствуют об участии рецепторов лептина в стимулирующем влиянии гормона на АЦ в лимфоцитах при изученных концентрациях у контрольной группы пациентов. При СД2 на фоне увеличения активности АЦ лептин не стимулировал фермент при концентрациях 10-11—10-9 М (см. рис. 2). Ослабленный АЦ-стимулирующий эффект выявлялся только при 10-8 М. Антитела блокировали это влияние гормона.

Таким образом, при СД2 наблюдаются изменения в регуляции АЦ: на фоне возрастания базальной активности фермента влияния изученных гормонов инсулинового семейства, ЭФР и лептина, а также фторида натрия на АЦСС ослабевают. Эти данные свидетельствуют о нарушении АЦ-стимулирующего действия как негормонального агента (фторида натрия), так и гормонов не только инсулиновой группы, но и лептина и ЭФР. Полученные результаты могут служить подтверждением нашей гипотезы о системном ответе эндокринной системы организма на дефекты в функционировании АЦСС при действии гормонов различной природы и полигормональном генезе молекулярных дефектов в АЦСС. Можно предположить, что нарушения в АЦ-стимуляции гормонами возникают как на рецепторных (что видно на примере лептина), так и на пострецепторных этапах передачи сигналов через АЦСС, и конкретно — на этапе взаимодействия Gs-белка и АЦ. Снижение функции Gs-белка при нарушении гормональной стимуляции АЦ подкрепляют данные о том, что чувствительность фермента к фториду натрия также снижается.

Выводы

1. Впервые показано стимулирующее влияние пептидов инсулинового семейства, ЭФР и лептина на активность АЦ в лимфоцитах человека.

2. При СД2 в лимфоцитах человека увеличивается базальная активность АЦ и снижается чувствительность АЦСС к фториду натрия, пептидам инсулинового семейства, ЭФР и лептину. Нарушения гормональной регуляции активности АЦ при СД2 связаны с функциональными дефектами, локализованными в случае лептина на рецепторном уровне, а в случае пептидов инсулинового семейства и ЭФР, скорее всего, на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.

Работа поддержана грантами: РФФИ 10-04-01052 и «Фундаментальные науки — медицине», 2011 г. Благодарим Е.А. Манову, к.м.н., врача-эндокринолога Клинической больницы РАН, Санкт-Петербург, за подбор больных и помощь в получении экспериментального материала.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail