Введение

Бруцеллез является зоонозным заболеванием, которое распространено более чем в 170 странах мира. В последние годы в России наметилась тенденция к ухудшению эпидемиологической ситуации по бруцеллезу, связанная с возникновением «завозных» эпизоотий крупного рогатого скота на крупных животноводческих предприятиях Центрального, Приволжского и Южного федеральных округов, а также с ухудшением эпизоотической ситуации по бруцеллезу в Республике Дагестан и ряде субъектов Сибирского федерального округа [1].

Вакцинация является одной из эффективных стратегий в борьбе с бруцеллезом. Тем не менее, в настоящее время не существует всемирно признанной вакцины против бруцеллеза для человека. Живая вакцина из Brucella abortus 19 ВА, которая применяется в Российской Федерации, имеет ряд побочных эффектов и противопоказаний [2].

Современные подходы в разработке вакцин против инфекционных заболеваний, с применением методов обратной вакцинологии, позволяют создавать профилактические препараты на основе иммунодоминантных белков с прогнозируемой эффективностью и высокими стандартами безопасности. К преимуществам подобных бесклеточных вакцин по сравнению с живыми и инактивированными вакцинами можно отнести их низкие реактогенность, аллергенность, токсичность, относительную простоту производства, транспортировки, масштабируемость, возможность использования у людей с хроническими заболеваниями, а также на фоне приема антибиотиков. Данный подход успешно применялся для разработки вакцин против таких патогенов, как Acinetobacter, Campylobacter, Chlamydia, Helicobacter, Francisella, Mycobacterium, Neisseria, SARS-CoV-2, Shigella и Staphylococcus [3].

В последние несколько лет растет число работ, посвященных изучению альтернативных подходов к иммунизации людей против бруцеллеза, в том числе использованию рекомбинантных субъединичных вакцин на основе белков бруцелл, таких как белки внешней мембраны (OMP16, OMP19, OMP31, OMP28 и OMP25), рибосомальный белок L7/L12, супероксиддисмутаза Cu-Zn, лумазинсинтаза BLS и других. Кроме того, активно разрабатываются ДНК- и векторные вакцины с использованием таких векторов, как Yersinia enterocolitica, Lactococcus lactis, Salmonella enterica, Escherichia coli, а также вируса гриппа [4]. Однако до настоящего времени эти новые подходы не привели к созданию коммерчески доступных вакцин против бруцеллеза.

В данной работе с помощью методов обратной вакцинологии был определен список из 47 перспективных бруцеллезных белков, обладающих вакцинным потенциалом против бруцеллеза, а также разработаны стратегии для их экспрессии в виде единичных и слитых рекомбинантных белков. Полученные белковые препараты были использованы в качестве in vitro стимуляторов при анализе цитокинпродуцирующей активности лимфоцитов, а также антигенов для детекции титров специфических антител у иммунизированных мышей.

Цель исследования — оценка иммуногенных свойств рекомбинантных белков бруцелл на клеточных культурах и сыворотках мышей линии BALB/c, иммунизированных вакцинным штаммом бруцелл.

Материал и методы

Получение рекомбинантных бруцеллезных белков

На первом этапе с помощью методов обратной вакцинологии были определены, как описано нами ранее, кандидатные бруцеллезные белки, обладающие вакцинным потенциалом [5]. Амплификацию генов белков бруцелл проводили с помощью ПЦР и SOE-ПЦР с ДНК штаммов Brucella abortus 544, B. melitensis биовар I C-479, B. suis биовар I 1330, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». В том числе было создано 2 химерные конструкции, состоящие из генов 2 и 3 белков (OMP19-OMP10, OMP25d-OMP19-OMP10), разделенных нуклеотидными последовательностями, кодирующими линкеры, а также произведена замена кодонов в 6 белках (LptD, HRA1, OMP16, OMP31, AlgE, BigB) с помощью метода SOE-ПЦР с целью снижения токсичности белков. Клонирование генов осуществляли в составе экспрессирующих векторов pET22b(+), pET24b(+), pET28b(+), pET32b(+), pACYCduet-1. В плазмиду pACYCduet-1 были клонированы гены двух белков для коэкспрессии целевого белка (LptD) с белком-шапероном (LptE), как описано ранее [6]. Экспрессию белков проводили в штаммах E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, Shuffle T7 (New England Biolabs). Очистку белков осуществляли металл-хелатной хроматографией в неденатурирующих и денатурирующих условиях с 6М мочевиной на иминодиуксусной сефарозе (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия). После диализа против фосфатного буфера концентрации 47 белков составили от 0,1 до 1,4 г/л. Чистота полученных препаратов белков по данным денситометрии составляла 97—99%, с содержанием эндотоксина, согласно ЛАЛ-тесту (Charles River Endosafe, США), менее 5 IU/мг.

Иммунизация мышей

В работе использовали 5 мышей линии BALB/c(H2d) (Питомник лабораторных животных «Пущино», Московская область, г. Пущино), массой 18‒20 г в возрасте 6‒8 нед. Протокол экспериментов с животными одобрен комитетом по биоэтике ФБУН ГНЦПМБ (№ ВП-2024/1A от 07.06.2024). Все работы с животными проводили в соответствии с ГОСТ33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Температура, влажность, вентиляция, и освещение соответствовали стандартным нормам для содержания животных. Животные имели свободный доступ к воде и корму. Мышей иммунизировали однократно внутрибрюшинно в дозе 106 КОЕ/мл штаммом B. abortus 19BA. В качестве контроля была использована группа интактных мышей.

Получение образцов сывороток. На 30-е сутки после иммунизации проводили эвтаназию животных, получали кровь, помещая в стерильные пробирки для исследования сыворотки Vacutest с активатором свертывания и гелем (Vacutest KIMA, Италия), отстаивали при комнатной температуре от 18 до 20 °C в течение 30—60 мин, затем центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. После центрифугирования сыворотки отбирали в стерильные пробирки, разделяли на аликвоты и хранили при минус 80 °C до использования.

Получение и стимуляция лимфоцитов

Для получения лимфоцитов проводили эвтаназию мышей, затем стерильно вскрывали брюшную полость и изолировали селезенки. Далее мышиные селезенки гомогенезировали через нейлоновый клеточный фильтр с диаметром поры 70 микрон (Fisher Scientific, США) в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Москва), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) производства Gibco, США. Полученную клеточную суспензию наслаивали на градиент плотности Histopaque-1,083 (Sigma, США) в соотношении 1:1 и центрифугировали в течение 30 мин при 400 g для последующего выделения мононуклеарных клеток. Далее отбирали опалесцирующее кольцо, содержащее клеточную взвесь, дважды отмывали в ФСБ с 2% ФБС, центрифугируя в течение 10 мин при 200 g. Клеточный осадок ресуспендировали в полной питательной среде следующего состава: среда RPMI 1640 («ПанЭко», Москва), 10 % ФБС, 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10 мМ HEPES (Flow, Великобритания), 40 мг/л гентамицина, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США). Жизнеспособность и концентрацию клеток определяли в тесте с трипановым синим на автоматическом клеточном счетчике TC20 (Bio-Rad, США). Количество жизнеспособных лимфоцитов доводили до концентрации 1·10⁶ клеток/мл.

В качестве специфического стимулятора в экспериментах in vitro использовали 47 рекомбинантных бруцеллезных белков (табл. 1). В качестве положительного неспецифического контроля при анализе цитокинпродуцирующей активности лимфоцитов использовали поликлональный активатор клеток Конканавалин A (Con A) производства Sigma, США. В качестве отрицательного контроля выступали клетки, инкубируемые в полной питательной среде RPMI в отсутствии антигенов. Лимфоциты инкубировали при температуре 37 °C, во влажной атмосфере, при концентрации CO₂ 5%. Уровень цитокинов в клеточном супернатанте определяли через 48 ч инкубации.

Таблица 1. Оценка иммуногенности рекомбинантных бруцеллезных белков у иммунизированных и интактных мышей линии BALB/c

Примечание. K⁺ — положительный контроль, K^— — отрицательный котроль. Lp — липопротеин, IpB — инвазин B.

Жирным шрифтом выделены названия белков с показателями концентрации ИФН-γ более 1000 пкг/мл.

Определение титров антител к рекомбинантным белкам B. abortus в сыворотке крови

В сыворотке крови мышей определяли уровень титров антител класса IgG к антигенам B. abortus методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве адсорбированных антигенов были использованы препараты 47 рекомбинантных белков высокой степени очистки в концентрации 10 мкг/мл. Связанные антитела определяли с помощью кандидатов вторичных кроличьих антител против цельной молекулы IgG мыши в рабочем разведении (1:5000), конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma, США). В качестве субстрата был использован 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB; Sigma, США). Учет результатов проводили на приборе Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, США), определяя оптическую плотность при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля была использована сыворотка интактных мышей.

Определение секретируемых цитокинов

Уровень цитокинов ИФН-γ и ИЛ-4 в клеточном супернанте определяли методом непрямого твердофазного ИФА согласно инструкции производителя (Krishgen, Индия). Учет результатов проводили на приборе Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, США), определяя оптическую плотность при длине волны 450 нм. Концентрации цитокинов рассчитывали с использованием стандартных кривых при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 6.00 для Windows (GraphPad Prism Software, США). Тесты контроля качества были включены в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты и обсуждение

Результаты ИФА показали, что значимые титры IgG антител к бруцеллезным антигенам выявлены для 8 антигенов (OMP16, LptE, OMP25-OMP19-OMP10, OMP19-OMP10, BtaE, OMP19, OMP28, L7/L12) и составили от 1: 6400 до 1:100, наиболее выраженная секреция ИЛ-4 в ответ на стимуляцию клеток бруцеллезными белками была выявлена для BepC и VirB1, однако меньшая значений положительного контроля ConA. Значимые концентрации ИФН-γ (более 100 пкг/мл) были определены для 41 белка, из них для 28 белков показатель был более 500 пкг/мл. Наиболее высокие концентрации ИФН-γ были выявлены для FliC, OmpA, OMP10, HRA1, BtpB, A1gE, Virb1, BtpA, Btaf, BtaE, BhuA, OMP25d, Virb8, LptE, Lptd/LptE. Результаты ИФА отражены в табл. 1. жирным шрифтом выделены названия белков с показателями концентрации ИФН-γ более 1000 пкг/мл.

В патогенезе бруцеллезной инфекции выделяют острую фазу, фазы бактериемии и распространения патогена в тканях, а также хроническую фазу, которая возникает в связи с персистированием бруцелл в клетках организма и уклонением их от действия специфического иммунитета [7].

Важную роль во взаимодействии бруцелл с организмом хозяина играют адгезины, которые обеспечивают прикрепление бруцелл к клеткам и компонентам внеклеточного матрикса уже через 1 ч после инфицирования. Наиболее изученными из них являются белки, связывающие эпителиоциты, эритроциты, а также гиалуроновую кислоту (BigA, BigB), коллаген I типа, фибронектин, фетуин, ламинин и витронектин (BtaE, BtaF, OMP28), рецепторы, содержащие сиаловые кислоты (SP29, SP41), а также мономерные автотранспортеры (BmaA, BmaB, BmaC), взаимодействующие с трофобластами, синовиальными клетками, остеоцитами, коллагеном I типа и фибронектином [8]. В нашей работе тестировано несколько рекомбинантных белков, относящихся к адгезинам, наиболее выраженные иммуногенные свойства показали трехмерные автотранспортеры (BtaE, BtaF), содержащий иммуноглобулин-подобный домен гликопротеин X (BigB), OMP28, а также глицерин-3-фосфатсвязывающий транспортный белок SP41. При этом для SP29, который, как неоднократно показано, связывается с поверхностью эритроцитов, представляющих основную фракцию инфицированных клеток в кровотоке, показатели были достаточно низкими, что объясняется, вероятно, неправильным фолдингом рекомбинантного белка.

Белки, экспонированные на поверхности клетки, наиболее вероятно являются мишенью для иммунной системы на ранних этапах инфицирования. Белки наружной мембраны (OMP) также входят в состав уникальных структур везикул внешней мембраны, которые секретируются бруцеллами. В данной работе исследован потенциал 15 таких белков (OMPA, OMP2b, OMP10, OMP16, OMP19, OMP25, OMP25с, OMP25d, OMP31, OMPW, OMPE, SOD, BhuA, BepC, BAB2_0314). Лучшие результаты были получены для белков OMPA, OMP10, OMP25d, OMPW, транспортера гема BhuA, термостойкого агглютинина BAB2_0314 и белка секреции I типа BepC. Для слитых белков OMP19-OMP10 и OMP25d-OMP19-OMP10 показатели были ниже, чем для единичных белков (OMP25d и OMP10).

Кроме того, высокую иммуногенность показали транспортер альгинатов A1gE и термостойкий агглютинин HRA1, которые были модифицированы с помощью замены 1 и 2 кодонов, соответственно, с целью снижения токсичности белков для людей.

Значимые показатели секреции ИФН-γ были выявлены для двух поверхностных белков- шаперонов, триггерного фактора Tig, участвующего в экспорте белка, и LptE, обеспечивающего правильное сворачивание транспортера липополисахарида (LptD) на поверхности клетки. Примечательно, что для шаперона LptE значения ИФН-γ оказались выше, чем для основного белка системы транспорта ЛПС (LptD) и для коктейля из двух белков (LptD/LptE), вероятно, образующих единый комплекс. Данные наблюдения требуют дальнейшего изучения.

Основным фактором вирулентности бруцелл, необходимым для их внутриклеточной выживаемости и персистенции, является система секреции IV типа (T4SS), которая включает белки VirB1-VirB12. Она участвует в создании репликативной ниши, реализует транслокацию в цитоплазму клетки хозяина более 15 эффекторных белков, обеспечивающих их жизнедеятельность и защиту. Два из них, BtpA (Btp1/TcpB) и BtpB, принадлежат к классу гомологов TIR домена, которые ингибируют TLR2/TLR4 и нарушают сигнальные пути NLRP3, подавляя иммунные реакции хозяина на ранних стадиях инфекции [9]. В данном исследовании мы детектировали высокие значения секреции ИФН-γ как на данные эффекторные белки (BtpA, BtpB), так и на белки T4SS (VirB1, VirB5, VirB8).

Известно, что геном Brucella содержит жгутиковые опероны, однако нет доказательств подвижности клеток. Тем не менее, было показано, что жгутиковые белки бруцеллы обеспечивают их патогенность, участвуют в росте клеток и образовании биопленок, а ухудшение условий среды может способствовать активации жгутиковых генов, обеспечивать механизмы защиты от иммунной системы. Например, было продемонстрировано, что белок FliC, формирующий наружный филамент жгутика, защищает бруцелл от обнаружения TLR5, но является мишенью цитозольного рецептора врожденного иммунитета NLRC4 [10]. В нашей работе мы тестировали 3 жгутиковых белка (FlgH, FlgK, FliC), из них только белок FliC показал высокую иммуногенность. Вероятно, это обусловлено его наиболее поверхностным расположением в мембране и большей доступностью для иммунных клеток.

Ключом к разработке более эффективных вакцин против бруцеллеза является индуцирование ими выраженного Th1 ответа, обеспечивающего защиту от внутриклеточной инфекции. В нашей работе для большинства исследуемых белков были получены высокие значения секреции ИФН-γ и низкие — ИЛ-4, что свидетельствует о превалировании Th1 над Th2 ответом на данные белки, и предполагает их протективность при использовании в качестве вакцинных препаратов. Детектирование антител IgG против нескольких белков, наряду с высокими показателями ИФН-γ, может объясняться продукцией клетками антител подкласса IgG2a, а не IgG1, что характерно для клеточного ответа, что будет рассмотрено в дальнейших исследованиях.

Заключение

В данной работе продемонстрирована способность полученных нами рекомбинантных белков индуцировать выраженный антигенспецифический ответ иммунных клеток в условиях ex vivo, что свидетельствует о их высоком иммуногеном потенциале, в том числе в отношении индукции Th1 ответа. Известно, что вакцины, основанные на одной субъединице белков, не способны обеспечить формирование протективного иммунитета, особенно при заражении высокими дозами возбудителя. Использование мультигенных и мультиэпитопных вакцин в комплексе с адьювантами может позволить достичь высокого уровня защиты от бруцеллезной инфекции.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания НИОКР 3.1.2.

Соблюдение этических стандартов. Все работы с животными проводились в соответствии с ГОСТ33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Протокол экспериментов с животными одобрен комитетом по биоэтике ФБУН ГНЦПМБ (№ВП-2024/1А от 07.06.2024).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.