Ретинобластома (РБ) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью сетчатки у детей, встречается довольно редко и составляет всего 3% от всех злокачественных новообразований детского возраста [1]. Во всем мире болезнь встречается с частотой 1 случай на 15 000—18 000 новорожденных [2]. Бинокулярная форма ретинобластомы чаще выявляется до первого года жизни ребенка, а монокулярная форма — до 3 лет. Наиболее распространенными клиническими признаками ретинобластомы являются лейкокория (белый зрачок) (60%) и косоглазие (20%). Опухоль имеет разный характер роста: эндофитный, при котором рост начинается во внутренних слоях сетчатки и опухолевые клетки диссеминируют в стекловидное тело; экзофитный, при котором опухоль растет в наружных слоях сетчатки и распространяется субретинально; смешанный (как эндофитный, так и экзофитный); диффузный инфильтрирующий [3]. Поражение оболочек глаза, зрительного нерва, сосудистой оболочки происходит в ходе последовательных событий по мере прогрессирования опухоли. После поражения сосудистой оболочки опухоль получает доступ к системному кровотоку (особенно при вовлечении в процесс цилиарного тела), что создает потенциал для метастазирования [4].

Несмотря на свою редкость, ретинобластома в связи с наличием семейных форм была первой опухолью, вызвавшей интерес у генетиков [5]. В конце 1960 г. А.Д. Кнудсоном была разработана двухударная теория, в которой было доказано, что опухоль развивается из-за мутации в длинном плече 13-й хромосомы. Нарушение функционирования белка RB, подавляющего рост опухоли, приводит к неконтролируемому делению клеток и повторяющимся геномным изменениям, что провоцирует рецидивы через длительный срок после ремиссии и развитие вторых опухолей, таких как остеосаркомы, меланомы и т.д. [6].

В настоящее время существуют лучевые, лазерные и химиотерапевтические методы лечения ретинобластомы, а также комбинация этих методов, целью которых является разрушение опухоли при минимизации сопутствующего повреждения окружающих тканей и органов.

Однако системная химиотерапия, широко распространенный метод лечения, обладает выраженным иммуносупрессивным действием и ведет к формированию вторичного иммунодефицита у значительной категории больных [6]. Как известно, эффективность лечения злокачественных новообразований, их прогноз в значительной степени связаны с состоянием иммунной системы пациента.

Имеется множество свидетельств нарушений как во врожденном, так и в адаптивном звеньях иммунитета при различных опухолях, в том числе и при новообразованиях органа зрения: так, при увеальной меланоме выявлен системный дисбаланс в составе лимфоцитов периферической крови, обусловленный выраженными разнонаправленными сдвигами преимущественно популяций NK-клеток и T-клеток [7].

При ретинобластоме основное внимание уделяется изучению локальных иммунологических механизмов, развивающихся в микроокружении опухоли [8], однако данные исследований, проводимых в этом направлении, достаточно разноречивы, что может быть обусловлено характером клинических выборок пациентов (особенностями формирования иммунной системы в разные периоды детского возраста, лечением и пр.), разными подходами к проведению иммуногистохимических исследований и способами учета их результатов.

Так, в работе L. Andersch и соавторов показано, что при ретинобластоме опухоль инфильтрирована в основном T-лимфоцитами (CD3⁺): показатель абсолютного числа этих клеток в ткани широко варьировал и составлял от 16,3—160,1 клеток/см² [9].

В других исследованиях приводятся данные, демонстрирующие наличие в микроокружении опухоли как T-клеток, так и B-клеток; не выработано единого мнения относительно NK-лимфоцитов — клеточного звена первой линии противоопухолевой защиты [8, 10].

Следует отметить, что исследований иммунологического статуса с выделением основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и оценкой качественного и количественного состава иммунокомпетентных клеток при первично выявленной нелеченой ретинобластоме не проводилось.

Для более глубокого понимания взаимоотношений в системе «иммунитет — опухоль» необходимы знания о состоянии основных звеньев системы иммунной защиты за пределами микроокружения опухоли.

Цель исследования — изучить состав основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови у детей с первично выявленной нелеченой ретинобластомой.

Материал и методы

В своей работе мы ориентировались на ABC-классификацию ретинобластомы (2001 г., Амстердам) и на этом основании разделили все опухоли на 5 групп: группа А (1 глаз), группа В (8 глаз), группа С (5 глаз), группа D (4 глаза), группа Е (10 глаз).

С 20 декабря 2023 г. до 1 сентября 2024 г. в отделении офтальмоонкологии и радиологии НМИЦ ГБ им. Гельмгольца обследованы 24 ребенка (48 глаз), ретинобластома выявлена в 28 глазах, возраст детей составил от 1,5 до 69 мес (средний возраст 17,6 мес). Из них пациентов в группе A — 1 ребенок (7 мес), в группе B — 6 детей (от 1 до 6 мес, средний возраст 3,2 мес), в группе C — 4 ребенка (от 1,5 до 23 мес, средний возраст 10,6 мес), в группе D — 4 ребенка (от 3 до 34 мес, средний возраст 17,3 мес) и с запущенной формой ретинобластомы (группа E) — 10 детей (от 4 до 69 мес, средний возраст 29,2 мес). Из них 14 мальчиков, 10 девочек, все дети были соматически здоровыми. Монокулярная форма выявлена у 20 больных, бинокулярная форма — у 4 (группа B и группа B; группа B и группа B; группа C и группа A; группа C и группа C), наследственная форма — у 2 детей, спорадическая — у 22.

Всем детям проводили общее клиническое обследование (сбор анамнеза, анализ медицинской документации) и стандартное офтальмологическое обследование, которое включало в себя визометрию (у младших детей — с помощью ориентировочных тестов: наблюдение за беззвучными предметами на разном расстоянии; у детей старшего возраста (от 2,5—3 лет) остроту зрения определяли по таблицам Сивцева, Орловой или с помощью колец Ландольта), тонометрию по Маклакову.

Биомикроскопию глаза у детей проводили с помощью ручной щелевой лампы.

Также всем было выполнено специализированное офтальмологическое обследование, которое включало офтальмоскопию с использованием педиатрической ретинальной фундус-камеры (RetCam 3, Clarity), ультразвуковое исследование глаза, спектральную оптическую когерентную томографию (ОКТ).

Офтальмоскопию проводили во время медикаментозного сна с максимальным мидриазом. Данная камера с помощью Rop-линзы с обзором 130° позволяет выявить изменения от центральных отделов до крайней периферии (с помощью склерокомпрессии) и вплоть до ora serrata.

Ультразвуковое исследование глаза в режиме B-сканирования (Philips Affinity 50) выполняли для оценки размера опухоли, характера роста опухоли, количества опухолевых узлов, наличия кальцификатов, вторичных изменений, таких как отслойка сетчатки, гемофтальм.

Спектральную ОКТ проводили на спектральном оптическом когерентном томографе (Heidelberg Engineering OCT Spectralis). С помощью данного исследования также уточняли диагноз ретинобластомы.

Материалом иммунологического исследования являлись пробы цельной крови, взятой из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9:00 до 10:00) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом K₃EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом лазерной цитофлуориметрии с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD Tru Count (BectonDickinson, США) на проточном цитометре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США). Для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов использовался лизирующий раствор BD FACS TM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Определяли относительное и абсолютное содержание T-клеток (CD3⁺), T-хелперов (CD3⁺CD4⁺CD8), T-цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD4^–CD8⁺), дубль-позитивных T-клеток (CD3⁺CD4⁺CD8⁺), NK- (CD16⁺CD56⁺) и B-лимфоцитов (CD19⁺), рассчитывали индекс CD4⁺/CD8⁺, отражающий баланс T-хелперов и цитотоксических T-клеток, с помощью программы Canto (Becton Dickinson, США).

Анализ изменений субпопуляционного состава лимфоцитов в крови детей основных клинических групп проводили на основании сравнения с показателями нормы клеточного иммунитета практически здоровых детей соответствующих возрастных периодов, установленными А.Ю. Щербиным и соавт. [12]. Статистическая обработка данных выполнена в программе Excel.

Результаты и обсуждение

В ходе общего анализа сдвигов в субпопуляционном составе лимфоцитов детей с ретинобластомой относительно нормы достаточно часто отмечался дисбаланс в основных клеточных типах — компонентах как врожденного (NK-клетки), так и адаптивного (T- и B-лимфоциты) звеньев иммунитета (рис. 1).

Рис. 1. Анализ частоты сдвигов относительных и абсолютных показателей лимфоцитов периферической крови у всех детей с первично выявленной нелеченой ретинобластомой относительно показателей нормы.

Наиболее часто выраженные разнонаправленные сдвиги относительно нормы касались относительного и абсолютного содержания NK-лимфоцитов: как известно, данные клетки обладают цитотоксичностью и играют важную роль в надзоре за опухолями. Функциональная активность NK-клеток также проявляется выработкой цитокинов и костимуляцией при непосредственном контакте с опухолью [11].

Обращает внимание, что указанные отклонения в абсолютном числе натуральных киллеров встречались в крови у 54,5% детей с ретинобластомой, частота выявления таких изменений в относительном содержании клеток составила 45,5% (см. рис. 1). Заметно чаще определялись сдвиги в сторону снижения показателей NK-лимфоцитов (CD16⁺CD56⁺), что дает основание предполагать ослабление противоопухолевого ответа.

Также отклонения часто затрагивали T-клеточное звено иммунитета: снижение показателей абсолютного и относительного числа T-цитотоксических клеток (CD3⁺CD8⁺) обнаруживалось примерно в 23% и 36% случаев соответственно, аналогичные сдвиги в процентном содержании CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов (T-хелперов) наблюдались примерно у трети (32%) пациентов.

В ходе исследования не было обнаружено взаимосвязей между полом пациентов и составом иммунокомпетентных клеток в крови.

При анализе частоты обнаружения изменений в субпопуляционном составе лимфоцитов при моно- и бинокулярной форме поражения органа зрения значительные различия были связаны со звеном NK-клеток.

Особо отметим, что в крови 75% детей с бинокулярной формой ретинобластомы наблюдались разнонаправленные отклонения в абсолютном и относительном количестве этой популяции относительно нормы, в то время как при одностороннем поражении данные сдвиги встречались реже и составили 55% и 40% соответственно.

Анализ результатов свидетельствует, что бинокулярные формы ретинобластомы чаще ассоциируются со снижением NK-клеток, что может указывать на недостаточность врожденного звена противоопухолевой защиты, более выраженную, чем при монокулярных формах заболевания (рис. 2).

Рис. 2. Частота сдвигов от нормы относительного и абсолютного количества NK-клеток при монокулярной и бинокулярной форме ретинобластомы.

Большой интерес также представляет исследование отклонений в субпопуляционном составе лимфоцитов в зависимости от объема и распространения опухоли согласно Международной классификации интраокулярной ретинобластомы (International Intraoculyar Retinoblastoma Classification — IIRC), на основании которой пациентов распределили в 5 клинических групп (A—E).

В ходе анализа данных особое внимание привлекли сдвиги в качественном и количественном клеточном составе основных звеньев иммунитета, обнаруженные у пациентов с начальной формой (группа B) — 6 детей (от 1,5 до 6 мес, средний возраст 2,9 мес) и запущенной формой (группа E) ретинобластомы — 10 детей (от 4 до 69 мес, средний возраст 36,5 мес) (рис. 3).

Рис. 3. Анализ частоты сдвигов относительно нормы в звене NK-клеток периферической крови у детей (группы B и E) с первично выявленной нелеченой ретинобластомой.

При оценке частоты сдвигов популяции NK-лимфоцитов выявлено, что снижение абсолютного содержания этих клеток относительно нормы, соответствующей возрастным периодам (по А.Ю. Щербину), чаще встречалось в группе детей с терминальной стадией ретинобластомы (группа Е), где составило 60%, что позволяет думать о выраженном ослаблении противоопухолевого ответа.

В группе В (с малым размером опухоли), напротив, у 50% пациентов наблюдалось значительное увеличение абсолютного числа NK-клеток и примерно в трети случаев повышение их относительного количества, что может указывать на защитную реакцию на начальной стадии заболевания.

В последние десятилетия многочисленные исследования подтвердили, что NK-клетки, являясь звеном врожденного иммунитета, играют ключевую роль в противоопухолевом надзоре — они непосредственно взаимодействуют с малигнизированными клетками, предотвращая их рост и развитие новообразований, инвазию и отдаленное метастазирование [13].

Интересные данные были получены при анализе абсолютного числа B-лимфоцитов (CD19⁺): так, у половины детей группы В было определено увеличение этого показателя относительно нормы соответствующего возрастного периода, в то время как у детей группы Е ни в одном случае не было обнаружено подобных сдвигов, а примерно в 30% случаев наблюдалось снижение данного показателя.

Показатели относительного количества B-клеток у детей с начальной стадией ретинобластомы соответствовали таковым в норме, однако в группе E отмечались разнонаправленные сдвиги данной популяции: примерно в половине случаев наблюдалось снижение и в 10% случаев произошло увеличение этих показателей относительно значений у здоровых детей соответствующего возраста (рис. 4).

Рис. 4. Частота сдвигов от нормы в звене B-лимфоцитов периферической крови у детей (группы B и E) с первично выявленной нелеченой ретинобластомой.

Как известно, B-лимфоциты выполняют множество функций в иммунной защите: могут выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток для стимуляции активации T-клеток, развивают гуморальный иммунный ответ, трансформируясь в плазмоциты, продуцирующие различные изотипы антител, а также секретируют широкий спектр цитокинов. Роль этой популяции является особенно важной в раннем детском периоде, поскольку изменения в B-клеточном звене определяют уровень общей иммунореактивности, ответ на вакцинацию. Недостаточное количество B-лимфоцитов связано с высоким риском инфекции [14, 15].

Обнаруженное нами повышение абсолютного количества CD19⁺ по отношению к норме в крови 50% пациентов группы В (до 12 мес, средний возраст 2,9 мес) можно рассматривать как защитный ответ организма в этот критически важный возрастной период, ответ, направленный на усиление резистентности.

Долгое время в онкоиммунологии не уделялось большого внимания гуморальному звену иммунитета, однако в последние годы ведутся интенсивные исследования взаимодействия B-клеток и опухолей: имеются работы, в которых демонстрируется способность данной популяции как стимулировать, так и предотвращать неопластический рост [16].

Учитывая вышесказанное, нужно подчеркнуть, что необходимы углубленные исследования с целью понимания роли B-клеток в патогенезе ретинобластомы для возможностей прогноза заболевания, мониторинга и разработки индивидуальной лечебной тактики. К сожалению, в литературе нет статей, посвященных этой тематике.

Колебания в звене T-лимфоцитов наиболее часто встречались в группе E и касались в основном T-цитотоксических клеток (примерно у 40% пациентов в крови наблюдалось их снижение): в целом это соответствовало тяжести клинической картины у данных пациентов.

Заключение

Полученные в ходе исследования предварительные результаты свидетельствуют о разнонаправленных изменениях в субпопуляционном составе лимфоцитов, выявленных у детей с первично обнаруженной нелеченой ретинобластомой:

— при начальной стадии заболевания (с малым размером опухоли) у половины (50%) детей наблюдалось увеличение абсолютного количества NK-лимфоцитов и B-лимфоцитов (CD19⁺);

— более тяжелая стадия заболевания ассоциировалась со снижением как абсолютного, так и относительного содержания NK-клеток, что дает основание говорить об ослаблении основного звена противоопухолевого надзора;

— требуются дальнейшие исследования (с расширением их спектра и дополнительным набором пациентов) с целью формирования базы данных и углубленного комплексного анализа данных клинико-инструментального обследования, иммуногистохимического исследования и параметров иммунологического статуса для определения прогноза и течения заболевания, индивидуальной тактики ведения офтальмоонкологических больных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Саакян С.В., Балацкая Н.В.

Сбор и обработка материала: Оганесян Л.К., Куликова И.Г.

Статистическая обработка: Оганесян Л.К., Куликова И.Г.

Написание текста: Оганесян Л.К.

Редактирование: Саакян С.В., Балацкая Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.