Влияние различных способов липосакции на культуральные свойства стволовых клеток жировой ткани

Процедура липосакции является одной из самых частых эстетических операций, проводимых ежегодно как в Российской Федерации, так и во всем мире, она уступает первое место только операциям по увеличению груди [1]. Ввиду высокой популярности этой процедуры на данный момент уже разработано множество способов забора жировой ткани: классическая липосакция, шприцевая, вибрационная, ультразвуковая, лазерная, водоструйная, радиочастотная и пр.

Богатая на клеточные элементы жировая ткань после забора чаще всего подвергается ферментативному расщеплению с использованием коллагеназы, реже используются неферментативные методы (центрифугирование, вибрационное разделение). После ферментативной обработки и центрифугирования жировой ткани в пробирке образуются три слоя, в нижнем из которых скапливается стромально-васкулярная фракция (SVF), состоящая из стволовых клеток жировой ткани (ADSC), перицитов, эндотелиальных клеток, эритроцитов, фибробластов, гладкомышечных клеток сосудов, гемопоэтических клеток и разнообразных клеток иммунной системы [2—4].

Использование ADSC приобрело популярность в регенеративной медицине, жировая ткань становится важным источником стволовых клеток взрослого организма, применяемых в пластической хирургии [5, 6].

На жизнеспособность и функции ADSC могут оказывать влияние как сами методы получения жировой ткани с последующей ее обработкой, так и множество индивидуальных факторов пациента, таких как возраст, пол, индекс массы тела (ИМТ), наличие хронических заболеваний, а также свойства донорской области [7—12].

Так, в ряде исследований сообщается о возможном негативном влиянии на выход SVF и характеристики ADSC высоких значений отрицательного давления. A. Mojallal и соавт. получили существенно бóльшую клеточность трансплантата из жировой ткани, собранной при более низком отрицательном давлении (–350 мм рт.ст.), чем при высоком отрицательном давлении (–700 мм рт.ст.) [13]. Y.-W. Chen и соавт. сообщили о более чем двукратном увеличении количества клеток в SVF, выделенной из жировой ткани, собранной при низком отрицательном давлении (–225±37 мм рт.ст.), чем в SVF из жировой ткани, полученной при высоком отрицательном давлении (–410±37 мм рт.ст.). Сообщалось и о более быстром росте клеток и большей секреции ряда факторов роста в клетках, полученных при более низком отрицательном давлении в начальных пассажах [14]. Другие же исследователи не обнаруживают существенных различий ни в жизнеспособности адипоцитов, ни в количестве мезенхимальных стволовых клеток в жировой ткани, полученной при различных отрицательных давлениях [15, 16].

Продолжаются споры и вокруг самих методик липосакции. Некоторые авторы указывают на то, что определенные способы получения жировой ткани негативно сказываются на характеристиках SVF и ADSC при коротких и длительных сроках культивирования. Однако большинство исследований являются парными — сопоставляются между собой только два метода липосакции, исследования не дублируются или включают в себя малое количество участников, поэтому остаются невоспроизводимыми, публикуются без оглядки на предшествующие — часто они несопоставимы между собой, например по выбору метода оценки жизнеспособности ADSC или кратности их пассирования перед оценкой иммунофенотипических характеристик.

Цель исследования — сравнительный анализ влияния на культуральные свойства ADSC вибрационной, шприцевой и классической липосакции при низком и высоком отрицательном давлении.

В исследование включены 36 женщин без хронических заболеваний в возрасте от 18 до 40 лет и с ИМТ от 20,0 до 30,0 кг/м². У всех женщин проводился забор жировой ткани последовательно из четырех различных областей: нижних и верхних заднебоковых отделов поясницы с обеих сторон. При этом для получения жировой ткани в каждой отдельной области применялся только один из четырех способов: 1) классическая липосакция при низком отрицательном давлении (–250 мм рт.ст.) (suction assisted liposuction low negative pressure — low-SAL); 2) классическая липосакция при высоком отрицательном давлении (–750 мм рт.ст.) (suction assisted liposuction high negative pressure — high-SAL); 3) шприцевая липосакция (syringe liposuction — SYR); 4) вибрационная липосакция (power assisted liposuction — PAL). Перед началом исследования выбор соответствия области и метода проведения липосакции для каждой из участниц устанавливали случайным образом, следуя процедуре рандомизации, реализованной в программе Statistica 12.0 (StatSoft Inc., 2014). Введение процедуры рандомизации направлено на исключение возможного влияния области сбора материала на результаты текущего исследования.

Липосакцию проводили с соблюдением правил асептики и антисептики в условиях общей анестезии после предварительной инфильтрации раствором Кляйна (1 л физиологического раствора, 1 мл адреналина 1:1000, 10 мл лидокаина 10%) тупой канюлей диаметром 3 мм типа Mercedes, прибегая к супервлажной технике. Время экспозиции составляло 30—40 мин для каждой области.

Для проведения классической липосакции использовался аппарат Medela Dominant Flex, который позволяет устанавливать постоянное отрицательное давление на показателях –250 мм рт.ст. и –750 мм рт.ст. Жировую ткань собирали с помощью тупой канюли для PAL Liposculptor типа MicroAire Tri-Port II с 3 отверстиями и внутренним диаметром 4 мм. Липосакция проводилась в двух областях с отрицательным давлением –250 мм рт.ст. и –750 мм рт.ст. соответственно.

При проведении шприцевой липосакции использовали тупую канюлю длиной 250 мм и диаметром 2,5 мм с 14 отверстиями диаметром 1,5 мм, подсоединенную к шприцу B. Braun Original Perfusor 50 мл через порт Luer-lock с поршнем, фиксированным зажимом на 2 см выше отметки «50 сс» для создания отрицательного давления. Шприцевая липосакция проводилась только в одной из четырех областей. Согласно литературным данным, максимальное давление, создаваемое в таком шприце, достигает при максимальном раскрытии –700 мм рт.ст. и со временем уменьшается почти до 0 мм рт.ст. [17].

Для забора жировой ткани с помощью вибрационной липосакции использовали аппарат PAL Liposculptor компании MicroAire с электрическим манипулятором с длиной хода возвратно-поступательного движения канюли 2 мм и частотой ходов 4000/мин в режиме 100% мощности. Жировую ткань собирали с помощью тупой канюли для PAL MicroAire типа Tri-Port II с 3 отверстиями и внутренним диаметром 4 мм. Вибрационная липосакция проводилась только в одной из четырех областей с отрицательным давлением –750 мм рт.ст.

По достижении изымаемого объема жировой ткани в каждой области, равного 50 мл, липоаспират, полученный при всех способах липосакции, доставлялся в лабораторию без дополнительной обработки или отмывания.

Липоаспират перемещали в центрифужные пробирки на 50 мл. Для удаления загрязняющих частиц и клеток крови липоаспират промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), затем обрабатывали раствором 0,075% коллагеназы I типа (Sigma) в PBS в течение 30 мин при 37°C и постоянном перемешивании. Коллагеназу инактивировали равным объемом среды DMEM, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и центрифугировали в течение 10 мин. Осадок клеток ресуспендировали в DMEM и 10% FBS, пропускали через фильтр с размером ячеек 100 мкм для удаления остатков [4]. Фильтрат центрифугировали и высевали в обычные флаконы для культивирования тканей в среде DMEM (Gibco), 10% FBS, дополненной 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и рекомбинантным человеческим фактором роста фибробластов (FGF2; 10 нг/мл; GenScript). Клетки, обозначенные «пассаж 0», культивировали до тех пор, пока они не сливались до 70—80%, затем клетки пассировали.

Выделенные клетки после 1-го пассажа высевали в 12-луночные полистирольные планшеты для культивирования тканей в среде DMEM, 10% FBS с добавлением 10 нг/мл FGF2 в течение 7 дней. Клетки культивировали при температуре 37°C в атмосфере увлажненного воздуха с 5% CO₂. На 7-й день 2-го пассажа клетки промывали PBS и инкубировали с раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich) в течение 4 мин при 37°C. Далее раствор трипсин-ЭДТА подавляли FBS и ресуспендировали. Количество, жизнеспособность отделившихся клеток в каждой лунке измеряли с использованием анализатора жизнеспособности клеток Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста исключения трипанового синего.

Проточная цитометрия проводилась с использованием FACScan (BD Biosciences). Клетки после культивирования на 2-м пассаже собирали и инкубировали в течение 30 мин в буфере для проточной цитометрии, содержащем моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) к следующим антигенам: CD31, CD34, CD44, CD45, CD59, CD105, CD146; конъюгированные с PE к следующим антигенам: CD13, CD29, CD73, CD90.

Для обработки данных применялись методы описательной статистики. Для определения средних величин, стандартного отклонения, медиан, интерквартильного интервала использовался программный статистический пакет Statistica v. 12.0 (StatSoft Inc., 2014). Для определения 95% доверительных интервалов (95% ДИ) медианы использовалась программа «Довинт v. 1.0» [18]. Сравнение показателей двух независимых признаков в выборках проводили с помощью непараметрического метода Манна—Уитни. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Для поправки величины p при проведении процедуры множественных сравнений воспользовались методом Бонферрони в модификации Холма [19].

Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил 34,2±4,3 года, а среднее значение ИМТ — 25,7±2,4 кг/м².

Оценка жизнеспособности показала, что вне зависимости от метода липосакции выживаемость ADSC после культивирования оставалась одинаково высокой и достигала значений, превышающих 90% (табл. 1).

Таблица 1. Жизнеспособность ADSC в зависимости от метода липосакции

Количество ADSC варьировало в достаточно широких пределах — от 0,098·10⁶/мл до 1,134·10⁶/мл. Однако средние значения, медианы и доверительные интервалы медианы не отличались сильно друг от друга при различных методиках липосакции, хотя в целом и были более высокими при SYR и PAL (табл. 2).

Таблица 2. Количество ADSC в зависимости от метода липосакции

Исключением явилась методика классической липосакции при высоком отрицательном давлении (high-SAL), которая по сравнению с остальными методами показала более низкие значения выхода ADSC после культивирования на единицу объема, достигшие статистически значимых различий (выделено жирным шрифтом в табл. 3) по сравнению со шприцевой липосакцией (SYR) (см. табл. 3, рисунок).

Таблица 3. Межгрупповое сравнение по количеству ADSC в зависимости от метода липосакции

Рис. Сравнение количества ADSC в зависимости от метода липосакции.

Как и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, ADSC экспрессировали на своей поверхности CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105. Экспрессия этих маркеров была очень высокой, и существенных различий в их экспрессии в зависимости от метода липосакции обнаружено не было. Экспрессия маркеров гемопоэза CD31, CD34, CD45 была очень низкой, и различий в их экспрессии в зависимости от метода липосакции также обнаружено не было. Была выявлена вариабельность экспрессии CD146 в пределах 9,8—18,8% (табл. 4, 5).

Таблица 4. Иммунофенотипические маркеры с высоким уровнем экспрессии

Таблица 5. Иммунофенотипические маркеры с низким уровнем экспрессии

В настоящем исследовании мы провели сравнительный анализ влияния на культуральные свойства ADSC различных способов липосакции: вибрационной, шприцевой, классической липосакции при низком отрицательном давлении (–250 мм рт.ст.) и классической липосакции при высоком отрицательном давлении (–750 мм рт.ст.). Оценка жизнеспособности показала, что вне зависимости от метода липосакции выживаемость ADSC после культивирования оставалась одинаково высокой и достигала значений, превышающих 90%. Для PAL полученный показатель выживаемости на 7-й день 2-го пассажа оказался, кажется, завышенным. Однако в исследовании A. Barzelay и соавт. более низкий показатель выживаемости, возможно, был достигнут из-за малой длительности культивирования [20]. Для других способов липосакции достигнутые показатели выживаемости были ожидаемо высокими. В исследовании M. Travnickova и соавт. низкое или высокое отрицательное давление не оказало влияния на выживаемость ADSC [21], так же как и на их количество. К такому же выводу пришли M. Keck и соавт., сравнивая PAL с ручной липосакцией [22].

В целом количество ADSC в нашем исследовании варьировало в относительно широких пределах — от 0,098·10⁶/мл до 1,134·10⁶/мл и при межгрупповом анализе статистически значимо не различалось, за исключением сравнения групп SYR и high-SAL. В исследовании L. Aust и соавт. количество клеток ADSC при low-SAL составило 404 тыс./мкл, что близко к их количеству в нашем исследовании [23]. Количество ADSC при low-SAL увеличивалось до 1,2 млн к 9-му пассажу, тогда как при PAL — до 2,4 млн [23].

ADSC в нашем исследовании вне зависимости от метода липосакции ко 2-му пассажу высоко экспрессировали на своей поверхности CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105 и практически не экспрессировали маркеры гемопоэтических клеток — CD31, CD34, CD45. A. Barzelay и соавт., сравнивая иммунофенотипические характеристики культуры ADSC, полученные после PAL и резекции жировой ткани, отмечали экспрессию CD90⁺, CD105⁺, CD73⁺, CD45⁻, характерную для всех мезенхимальных стволовых клеток [20].

Практически всегда при культивировании ADSC отмечается высокий уровень экспрессии CD105, CD90, CD73 и CD29 (>80%) и низкий уровень экспрессии гемопоэтических маркеров CD45, CD31 и CD33 (≤2%) или их полное отсутствие [24]. Даже несмотря на то что в исследовании Y.-W. Chen и соавт. высокое отрицательное давление оказывало отрицательное влияние на количественные характеристики ADSC, различий в экспрессии CD-маркеров по сравнению с low-SAL не было [14].

Обнаруженная нами вариабельная экспрессия CD146 на ADSC в пределах 9,8—18,8% подтверждается исследованием N. Lee и соавт., наблюдавших похожую вариабельность экспрессии CD146 при культивировании ADSC, что может служить признаком присутствия перицитов. Однако при увеличении количества пассажей процент CD146-положительных ADSC существенно снижался [25].

Главной особенностью настоящего исследования является то, что впервые было изучено влияние распространенных в Российской Федерации способов липосакции на культуральные свойства ADSC, исходя из единых подходов к их культивированию, оценке их количества, жизнеспособности и фенотипических особенностей. Было показано, что выбор того или иного метода липосакции практически не оказывает влияния на культуральные свойства ADSC, за исключением негативного влияния высокого отрицательного давления на выход ADSC при ограниченном количестве пассажей. Мы считаем, что выбор метода липосакции не влияет на возможность ее успешного использования для накопления и длительного хранения достаточного количества ADSC с целью последующего их клинического применения в тканевой инженерии. Ограничениями нашего исследования являются: женский пол, молодой возраст, относительно низкий ИМТ и отсутствие хронических заболеваний у исследуемых.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.А. Коэн, А.Ю. Устюгов, Н.Е. Мантурова

Сбор и обработка материала — И.А. Коэн, А.Ю. Устюгов

Статистическая обработка — И.А. Коэн

Написание текста — И.А. Коэн, А.Ю. Устюгов

Редактирование — И.А. Коэн, А.Ю. Устюгов, Н.Е. Мантурова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.