Введение

В данной статье рассматриваются модификации одного из самых распространенных хирургических вмешательств на передней брюшной стенке (ПБС) в условиях инфицированного грыжевого дефекта — герниопластика. С каждым годом количество выполняемых операций увеличивается [1] (рис. 1, 2).

Рис. 1. Распространенность хирургических вмешательств на передней брюшной стенке по данным Шведского грыжевого регистра.

Рис. 2. Тенденции в герниопластике в период с 2009 по 2018 г. по данным Национальной программы повышения качества хирургии.

Актуальной проблемой является поиск наиболее рационального способа пластики грыжевого дефекта ПБС в зависимости от структурных и количественных изменений в ультраструктуре соединительной ткани, выявляемых с помощью гистологического исследования.

В настоящее время «золотым стандартом» в лечении грыж ПБС является пластика с помощью полипропиленовой сетки [2]. Тем не менее это оперативное вмешательство имеет широкий диапазон вероятности развития осложнений (от 1 до 24%), таких как наличие инфильтрата или нагноение постоперационной раны, приводящих к отторжению замещающего материала, особенно в условиях инфицированной раны [2, 3]. Наиболее перспективным методом, который может конкурировать с вышеупомянутым, является использование биоинженерных трансплантатов с помощью децеллюляризации [4, 5].

Цель исследования: сравнение показателей состава рубца ПБС в зависимости от используемого способа герниопластики в условиях инфицированной раны и определение хирургически наиболее обоснованного.

Материал и методы

В настоящей работе путем сравнительного анализа, основу для изучения которого составляет содержание тканевых элементов послеоперационного рубца, сделан выбор наиболее рационального способа герниопластики в условиях инфицированной раны между биотрансплантатом, полученным с помощью децеллюляризации 2% раствором додецилсульфата натрия (SDS), простой средней полипропиленовой сетки (ППС) и местными тканями. Дизайн исследования представлен на рис. 3.

Рис. 3. Дизайн исследования инфицированного грыжевого дефекта передней брюшной стенки.

Крысы-самцы породы Вистар (n=90) случайным образом были разделены на 3 экспериментальные группы по 30 особей в каждой.

Хирургические вмешательства проведены в стерильных условиях с использованием общей анестезии с применением изофлурана ингаляционно в концентрации 3,5 об/% со скоростью потока 3,5±0,5 л/мин.

После фиксации животного и обработки операционного поля проведено моделирование грыжевого дефекта ПБС овальной формы (20×15 мм) путем иссечения мышечного массива глубиной до ¹/₃ толщины поперечной мышцы живота и введения в нее взвеси по разработанному А.А. Андреевым и соавт. [6] способом. Затем во всех экспериментальных группах была выполнена пластика грыжевого дефекта тем или иным способом. Животным 1-й группы (основная) выполнена пластика биотрансплантатом, полученным с помощью децеллюляризации 2% раствором SDS, способом onlay. Биотрансплантат был получен от кроликов-самцов породы Белый Великан, массой 6—7 кг, достигших возраста 8—9 мес. На аутопсии в стерильных условиях у каждого кролика в центральном отделе ПБС забирали участок размером 8×6 см, состоящий из фрагментов апоневроза, прямой и наружной косой мышц живота. Децеллюляризацию выполняли при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере (Biosan) со скоростью 140 об/мин при температуре 8—10 °C 2 об/% раствором додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде с добавлением 45—50 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) в течение не менее 3 ч, затем материал промывали дистиллированной водой и помещали в стерильные пробирки при температуре 8—10 °C с 1 об/% раствором Triton X-100 в дистиллированной воде с 20—25 мМ EDTA в PBS, перемешивая на орбитальном шейкере со скоростью 140 об/мин, продолжительность обработки не менее 3 ч.

У 2-й экспериментальной группы (группа сравнения) выполнена пластика с помощью простой средней полипропиленовой сетки Эсфил стандартный (ООО «Линтекс») способом onlay. У 3-й группы (контроль) была использована пластика местными тканями способом по Сапежко.

Продолжительность исследования составила 180 сут, что соответствует запланированному периоду исследования.

На 30-е и 180-е сутки были выведены из эксперимента по 15 крыс из каждой группы путем передозировки изофлурана ингаляционным путем. Затем у каждой особи был взят фрагмент послеоперационного рубца для морфологического исследования.

Составляющей частью соединительной ткани, которая лежит в основе формирования рубца, являются коллагеновые и эластические волокна. Тип, количество и организация коллагена изменяются во время заживления ран и определяют прочность рубца. Коллаген стимулирует митогенез, синтез факторов роста, воспалительных цитокинов, а также может улучшать фагоцитоз и иммунный ответ посредством экспрессии генов [7]. В настоящей статье рассмотрены 2 основные типа коллагена — I и III. Коллаген III типа формируется на первых этапах процессов регенерации, переходя на завершающих этапах формирования рубца в коллаген I типа. Чем больше в составе рубца коллагена III типа, тем активнее проходят адгезия, миграция, дифференцировка клеток, что способствует уменьшению риска дисрегенерации. При этом эластические волокна обеспечивают растяжимость и подвижность рубца. Белки эластина, входящего в состав волокон, индуцируют различные пути транспорта кальция, миграции кератиноцитов и фибробластов, а также оборота внутриклеточного матрикса [8, 9]. Исследуя соотношение эластических и коллагеновых волокон, стоит упомянуть об их связи между собой. Только в присутствии обеих структур, объединенных в каркасы, будут обеспечены максимальная прочность и эластичность тканей.

При гистологическом исследовании использовали следующие методы окраски соединительной ткани: пикросириусом красным и по Пикро-Маллори. Исследование проведено с помощью микроскопа Leica DMR, цифровой камеры Leica DFC295, платы оцифровки Leica (Германия).

Морфологическое исследование проводили двумя способами — окраска пикросириусом красным и по Пикро-Маллори. Алгоритм окрашивания по Пикро-Маллори следующий: изготовлены парафиновые срезы из фрагмента постоперационного рубца, затем проведены депарафинизация и гидратация срезов с помощью растворов ксилола, этилового спирта, дважды дистиллированной воды. В течение 1 ч проводилась окраска пикросириусом красным. Подготовлена подкисленная уксусной кислотой вода с целью промывки предметного стекла после окраски пикросириусом красным. Удалены излишки воды со стекла, дегидратация путем трехкратного погружения среза в 100% этиловый спирт. На конечном этапе осуществлено просветление предметного стекла двукратно путем погружения среза в 100% раствор ксилола, затем в смолистую среду. При исследовании препаратов, окрашенных пикросириусом красным, в поляризованном свете, демонстрирующем двоякое лучепреломление коллагеновых волокон, более толстые коллагеновые волокна приобретают ярко-желтый или оранжевый цвет, а более тонкие и ретикулиновые волокна — зеленый.

Окрашивание препаратов по Пикро—Маллори проводили по следующему алгоритму: были изготовлены парафиновые срезы. Следующим этапом осуществляли их депарафинизацию и регидратацию, после чего предметное стекло было помещено в жидкость Буэна, затем промыто дистиллированной водой. После этого выполнено прокрашивание среза железным гематоксилином Вейгерта с последующим погружением в желтую протраву и промывкой стекла под проточной водой. Затем срез последовательно был помещен в красный, далее в синий краситель. После каждого красителя предметное стекло промывали подкисленной дистиллированной водой. При трихромном окрашивании по Пикро-Маллори препарат проходит 2 этапа дифференцировки: сначала в красном дифференциаторе, затем в синем, пока составляющие соединительной ткани не станут заметны под микроскопом. Коллагеновые волокна окрашиваются в темно-синий цвет, эластические — приобретают окраску от бледно-розового до желтого.

Основным исходом исследования было успешное проведение пластики — восстановление ПБС с использованием биотрансплантата, сетчатого имплантата и местных тканей. К дополнительному исходу исследования можно отнести развитие более выраженного процесса инфицирования раны с вовлечением имплантированной сетки и ее отторжение у 5 особей.

Исследование одобрено этическим комитетом базы исследования (этический комитет при ГБОУ ВО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России утвержден приказом ректора №303 от 04.10.2006; протокол №7 от 08.11.2021). Этический комитет осуществляет свою деятельность в соответствии с положениями и нормами законодательных актов Российской Федерации в области охраны здоровья граждан, на основании Федерального закона от 12.04.2010 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», приказа Минздравсоцразвития России от 26.08.2010 №748н «Об утверждении порядка выдачи разрешения на проведение клинического исследования лекарственного препарата для медицинского применения», в соответствии со стандартом отрасли «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» (ОСТ 42-511-99, утв. Минздравом России от 29.12.1998), Уставом ФГБОУ ВО «ВГМУ им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием IBM SPSS Statistics. Сравнение в группах выполняли с помощью непараметрического критерия Краскела—Уоллиса. Изменения показателей считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

При внешнем осмотре послеоперационной раны на 30-е сутки у 16% подопытных 2-й экспериментальной группы отмечены признаки отторжения сетчатого имплантата. Наблюдалась типичная пентада признаков воспалительной реакции в области раны, а также выделение гноя. К 180-м суткам инфекционный процесс купирован, на месте раны сформирован линейный плотный рубец бледно-розового цвета.

На 30-е стуки у остальных 85% особей образовалась соединительная ткань на месте закрытия грыжевого дефекта. Рана уменьшилась в размере. На 180-е сутки у всех экспериментальных животных 1, 2 и 3-й групп завершилась репарация послеоперационного рубца.

Результаты гистологического исследования фрагмента рубца, взятого на 30-е и 180-е сутки после операции, представлены в табл. 1, 2.

Таблица 1. Значения измеряемых показателей в различных группах животных на 30-е сутки после операции

Примечание. * — изменения показателей статистически значимы при p<0,05. SDS — раствор додецилсульфата натрия; ППС — полипропиленовая сетка.

Таблица 2. Значения измеряемых показателей в различных группах животных на 180-е сутки после операции

Примечание. * — изменения показателей статистически значимы при p<0,05. SDS — раствор додецилсульфата натрия; ППС — полипропиленовая сетка.

Согласно приведенным данным, на 30-е сутки эксперимента различие между содержанием коллагена в послеоперационном рубце I и III типов после пластики местными тканями (контрольная группа) и использованием биотрансплантата были статистически незначимыми (p_т—м=0,070). При этом различие между ППС и контрольной группой по этим же показателям является существенным (p_п—м<0,001). Эти данные показывают, что после операции с использованием биотрансплантата прочность рубца не будет уступать рубцу, сформированному после пластики дефекта местными тканями. Изменения остальных показателей (процентное содержание коллагеновых и эластических волокон) по всем трем группам наблюдений статистически значимы (p_п—м<0,001; p_т—м<0,001; p_т—п=0,001).

На 180-е сутки различие между содержанием коллагена I и III типов в послеоперационном рубце после пластики биотрансплантатом и местными тканями статистически незначимо (p_т—м=0,965 и p_т—м=0,410 соответственно при p<0,05). При этом уровень значимости различий между ППС и контрольной группой по этим показателям составляет p_п—м<0,001, что свидетельствует о большой разнице между содержанием двух типов коллагенов во 2-й и 3-й группах исследуемых. Процентное соотношение коллагеновых волокон между ППС и биотрансплантатом существенно не различается (p_т—п=0,532). Однако между этими группами и контрольной группой изменение коллагеновых волокон статистически значимо (p_п—м<0,001; p_т—м<0,001). Такие же результаты показывает исследование содержания эластических волокон: незначительные различия между 1-й и 2-й группами (p_т—п=0,156) и статистически значимые — между биотрансплантатом, ППС и местными тканями (p_т—м<0,001; p_п—м<0,001).

При гистологическом исследовании послеоперационного рубца с использованием биотрансплантата, окрашенного пикросириусом, обнаруживается отек, визуализируются полнокровные сосуды, плотные регулярные коллагеновые волокна (рис. 4). Определяются плазматические клетки, большое количество фибробластов, грануляционная ткань с большим количеством мелких сосудов (рис. 5).

Рис. 4. Герниопластика раневого дефекта биотрансплантатом, полученным с помощью децеллюляризации 2% SDS. Полнокровные капилляры, образование плотных регулярных коллагеновых волокон. Пикросириус.

а — ×100; б — ×200. SDS — раствор додецилсульфата натрия.

Рис. 5. Герниопластика раневого дефекта биотрансплантатом, полученным с помощью децеллюляризации 2% SDS. Преобладание коллагеновых волокон I типа. Пикросириус в поляризованном свете.

а — ×100; б — ×200. SDS — раствор додецилсульфата натрия.

На 30-е сутки происходит формирование плотных регулярных коллагеновых волокон с преобладанием коллагена I типа.

После пластики грыжевого дефекта ППС наблюдаются отек тканей, формирование нерегулярных волокон, коллагеновые волокна III типа преобладают над волокнами I типа (рис. 6).

Рис. 6. Герниопластика раневого дефекта полипропиленовой сеткой.

а — отек соединительной ткани и нерегулярные волокна: фрагмент ткани окрашен гематоксилином и эозином, ×100; б — преобладание коллагеновых волокон III типа, имеющих зеленое свечение: фрагмент ткани окрашен пикросириусом и исследован в поляризованном свете, ×200.

В контрольной группе, в которой в качестве материала для герниопластики использовались местные ткани, во фрагменте послеоперационного рубца обнаруживались регулярные, плотные коллагеновые волокна небольшой толщины с преобладанием коллагена I типа (рис. 7).

Рис. 7. Фрагмент послеоперационного рубца в контрольной группе, в которой в качестве материала для герниопластики использовались местные ткани.

а — плотные коллагеновые волокна небольшой толщины: ткань окрашена пикросириусом, ×100; б — исследование в поляризованном свете, ×200: желтое и красное свечение, что свидетельствует о преобладании коллагеновых волокон I типа.

Обсуждение

В настоящем исследовании показана альтернативная возможность пластики грыжевого дефекта, которая по многим показателям (низкий риск отторжения в инфицированной ране, морфологические показатели прочности и эластичности соединительнотканного рубца) является лучшей. В настоящее время «золотой стандарт» — использование ППС — несет определенные риски, такие как наличие инфильтрата или нагноение постоперационной раны, приводящие к отторжению замещающего материала, особенно в условиях инфицированной раны [2], и наша методика направлена на их минимизацию.

На территории Российской Федерации этот метод герниопластики в практике не применяется. За пределами Российской Федерации в практической медицине используют биологический имплантат Permacol с целью закрытия дефекта брюшной стенки. Он изготовлен из листовой свиной кожи, после обработки представляет собой чистый поперечно-связанный коллаген и эластин, лишенный клеточных структур, жировой ткани [10]. Страна-производитель — Франция, в связи с чем поставка материала затруднена и требует больших материальных затрат. В перспективе мы предлагаем производство и внедрение в практику отечественного имплантата. Этим будет решен ряд проблем. Во-первых, операции, проводимые с использованием биотрансплантата, полученным с помощью децеллюляризации 2% раствором SDS, технически проще. Во-вторых, исчезает потребность в использовании дополнительного финансирования для осуществления импорта. Безусловно, при использовании биотрансплантата не исключен риск развития осложнений, рецидива заболевания. Однако на основании представленных статистических данных можно сделать вывод, что использование ППС и местных тканей может дать такой же отрицательный результат. Имплантат, в отличие от других методов, способствует прорастанию тканей и васкуляризации с минимальной воспалительной реакцией, что благоприятно влияет на прочность рубца. Формирование более или менее прочного рубца полностью не защищает от возможности возникновения рецидива заболевания, но снижает вероятность его возникновения [11].

Лечение грыжевого дефекта хирургическим путем является одним из самых распространенных хирургических вмешательств во всем мире. В настоящее время основным способом закрытия грыжевого дефекта остается применение ППС, а также возможно применение местных тканей.

В нашем исследовании при сравнении трех способов выполнения герниопластики с использованием различных материалов на основе анализа состава постоперационного рубца более качественным с точки зрения морфологических показателей прочности и эластичности оказался соединительнотканный рубец, образованный после внедрения биотрансплантата. Соединительнотканный рубец у крыс 1-й группы по содержанию коллагена был схож с рубцом контрольной группы, поэтому мы можем утверждать, что он обладает более высокой прочностью, чем у подопытных с ППС. Рубец после применения аллотрансплантата в качестве способа лечения грыж обладает удовлетворительными морфологическими показателями, поэтому эта группа являлась контрольной. Однако на практике использование герниопластики с помощью местных тканей приводит к возникновению дегенеративных процессов в тканях и, как следствие, рецидивов. Кроме того, искусственно измененная форма мышц часто сопровождается развитием миогенной контрактуры. Использование полипропиленовой сетки в инфицированной ране, по результатам эксперимента, влечет за собой высокий риск отторжения (16%), что ограничивает ее применение на практике. Рубец, сформированный у группы, которой выполнялась пластика с помощью ППС, по морфологическим показателям уступал двум другим группам. Исходя из этого, можем сделать вывод о преимуществе биотрансплантата перед ППС и местными тканями.

Заключение

Настоящее исследование позволяет удостовериться в том, что биотрансплантат, полученный с помощью децеллюляризации 2% раствором додецилсульфата натрия при дальнейшем исследовании и усовершенствовании может стать достойной альтернативой полипропиленовой сетки. Так как он, в отличие от полипропиленовой сетки, обеспечивает развитие качественного послеоперационного рубца, не способствует развитию воспалительной реакции и отторжению трансплантата, а также не дает токсический эффект.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Черных А.В., Магомедрасулова А.А., Шевцов А.Н., Токмачев Р.Е.

Сбор и обработка материала — Магомедрасулова А.А., Шевцов А.Н., Кабанова С.Н., Киселева А.Г.

Статистическая обработка — Шевцов А.Н.

Написание текста — Черных А.В., Магомедрасулова А.А., Кабанова С.Н., Киселева А.Г.

Редактирование — Черных А.В., Магомедрасулова А.А.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Chernykh A.V., Magomedrasulova A.A., Shevtsov A.N., Tokmachev R.E.

Data collection and processing — Magomedrasulova A.A., Shevtsov A.N., Kabanova S.N., Kiseleva A.G.

Statistical processing of the data — Shevtsov A.N.

Text writing — Chernykh A.V., Magomedrasulova A.A., Kabanova S.N., Kiseleva A.G.

Editing — Chernykh A.V., Magomedrasulova A.A.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.