Доказательные аспекты стимулирования заживления неосложненной раны при локальном применении серебряной соли ацексамовой кислоты

Число пациентов с ранами, полученными в результате травм различной этиологии, продолжает оставаться высоким, в связи с чем лечение данной патологии является одной из актуальных проблем хирургии [1, 2]. В свою очередь устойчивость микроорганизмов к противомикробным препаратам, иммунодепрессивные состояния и другие причины, замедляющие процессы регенерации, приводят к нагноению ран, развитию сепсиса и значительно снижают эффективность лечения, а также увеличивают его длительность и стоимость [2].

Процесс заживления ран включает несколько фаз: воспаление, пролиферацию и ремоделирование тканей [3]. На первом этапе в результате экссудативно-деструктивных изменений, включающих распад белков, анаэробный гликолиз с накоплением токсичных продуктов распада, высвобождение внутриклеточного калия, происходит вазодилатация, гиперемия, отек тканей и развитие болевого синдрома [4, 5]. Все это приводит к миграции лейкоцитарных клеток в зону повреждения для предотвращения инфекции [3]. На втором этапе развиваются пролиферативные процессы, ведущие к образованию грануляционной ткани. Появляющиеся фибробласты начинают синтезировать широкий спектр молекул внеклеточного матрикса, восстанавливая структуру и функцию кожи в области раневого дефекта, при этом образуются новые кровеносные сосуды для восстановления кровообращения [5].

Восстановление поврежденных тканей в ране приводит к формированию рубца. Если затягивание раны происходит первичным натяжением, то формируются, как правило, косметически тонкие и невидимые рубцы, однако другие могут трансформироваться в грубые растянутые, вдавленные, гипертрофические и келоидные, что связано с чрезмерной экспрессией молекул внеклеточного матрикса во время пролиферативной и ремоделирующей фаз заживления ран [6—8]. В отличие от гипертрофических рубцов, келоидные рубцы прогрессируют за пределы исходной раны и со временем не регрессируют [9].

Одним из путей решения проблем инфицирования и длительной регенерации раневых дефектов является применение органических кислот, к числу которых относятся ацетиламиногексановая кислота (ацексамовая кислота), а также ее производные, широко использующиеся в качестве действующих веществ лекарственных препаратов.

Известно, что у крыс под влиянием ацексамовой кислоты обнаруживаются признаки высокой синтетической активности клеток фибробластического ряда. Заживление ран кожи в условиях применения ацексамовой кислоты было более благоприятным по сравнению с контролем [9—11].

Представляется перспективным синтез новых производных ацексамовой кислоты с целью создания эффективных лекарственных средств, поскольку ацексамовая кислота и ее производные обладают широким спектром биохимической активности в организме человека [12]. Таким образом, анализ отечественной и зарубежной научной литературы свидетельствует о высоком потенциале солей ацексамовой кислоты как стимуляторов регенерации, что обусловливает актуальность разработки на их основе перспективных лекарственных средств.

Экспериментальные исследования, одобренные локальным этическим комитетом Медицинского института Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (протокол № 8, октябрь 2018 г.), выполнены на беспородных 30 белых крысах обоего пола (питомник «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России) весом 180—220 г, разделенных на 3 группы по 10 особей в каждой: контроль, группа сравнения, опытная группа.

В качестве изучаемого соединения использовалась мягкая лекарственная форма (линимент) серебряной соли N-ацетил-6-аминогексановой кислоты с лабораторным шифром ЛХТ 7-17, разработанная в отделе химии, технологии синтетических лекарственных средств и аналитического контроля АО «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна, Россия). Перед началом эксперимента животных наркотизировали внутривенным введением золетила в дозе 50 мг/кг. Плоскую неинфицированную рану формировали одноразовым скальпелем по трафарету, представляющему собой вырезанный в стерильной одноразовой пеленке квадрат (S=400 мм²). Иссекали кожу с подкожной жировой клетчаткой до фасции спины, рану оставляли открытой до полного рубцевания (рис. 1).

Крысам опытной группы наносили исследуемую мазь на 2-е, 6-е и 12-е сутки после формирования патологии. Животным группы контроля наносили 0,9% раствор хлорида натрия, крысы группы сравнения получали препарат «Пантенол» (флакон 130 мл, ООО «АЛТЕЯ»). Ежедневно измеряли площадь раны электронным штангенциркулем и вычисляли процент сокращения раневого дефекта. В каждой группе на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента, вырезали раневой дефект в радиусе 1,0—1,5 см от краев раны на всю ее глубину с последующей фиксацией в нейтральном забуференном 10% растворе формалина в течение 48 ч. Из полученного биоматериала готовили парафиновые блоки в автоматическом режиме.

В качестве маркеров клеточной пролиферации и регенерации, а также васкуляризации использовали Ki-67 и CD34. Анализ иммуногистохимической реакции производили в 6 полях зрения при увеличении 400. В целях оценки иммуногистохимической реакции на Ki-67 определяли индекс пролиферации, для чего подсчитывали количество позитивно окрашенных ядер фибробластов в полях зрения, определяли их отношение к общему числу ядер в исследуемых областях и полученное отношение выражали в процентах.

Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики, использовали параметрический критерий Ньюмена-Кейлса и непараметрический точный критерий Фишера. Нормальность распределения определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа (ANOVA). Кривую выживаемости анализировали с помощью критерия Гехана с поправкойЙейтса. Использовали пакет программ по статистике SPSS (версия 16.0).

При изучении динамики заживления плоской раны нами было установлено, что нанесение исследуемого вещества ЛХТ 7-17 приводит к сокращению сроков закрытия раневого дефекта, при этом сроки заживления сопоставимы со сроками заживления при использовании препарата сравнения «Пантенол» (рис. 2). Следует отметить, что размеры раны на 7-е сутки эксперимента в исследуемых группах сокращаются более чем в 2 раза, а площадь и форма рубца, образующегося первичным натяжением, к 15-м суткам имеет хороший косметический эффект.

В контрольной группе животных в 1-е сутки эксперимента морфологическая картина раневого дефекта характеризовалась наличием выраженного некротического процесса, полнокровия сосудов и стаза эритроцитов в капиллярах. На 3-и сутки отмечался выраженный отек с увеличением количества лейкоцитов и макрофагов. На 7-е сутки происходило формирование молодой грануляционной ткани, содержащей фибробласты и тучные клетки, однако у некоторых животных сохранялась лимфогистиоцитарная инфильтрация с небольшими участками некроза. К 14-м суткам рана полностью очищалась от некротических масс, замещалась молодой грануляционной тканью, содержащей фибробласты, продуцирующие коллагеновые волокна. К 21-м суткам у 70% животных кожный дефект замещался рубцовой тканью на фоне слабой краевой эпителизации. У 30% крыс сохранялись явления воспаления, в среднем к 28-м суткам происходило заживление раны вторичным натяжением.

Результаты нанесения мягкой лекарственной формы ЛХТ-7-17 и препарата сравнения на 3-и сутки эксперимента отличались от результатов, полученных в группе контроля, умеренным воспалительным процессом и меньшим объемом очагов некроза; отмечалась выраженная сосудистая реакция, в области дна раны появлялись очаги грануляционной ткани. К 7-м суткам рана полностью закрылась грануляционной тканью с явлениями эпителизации. Рана полностью очищена от некротических тканей и выполнена многослойным ороговевающим эпителием, что в совокупности свидетельствует о закрытии раны первичным натяжением за счет реституции.

В дерме наблюдается множество капилляров (до 50 в поле зрения), при этом хорошо заметно накопление действующего вещества линимента, содержащего ЛХТ-7-17, в перикапиллярной зоне в виде черных точек и гранул (рис. 3).

При изучении этапов закрытия раны использовали показатель Ki-67 — маркер клеточной пролиферации и регенерации. В экспериментах показано, что на 3-и сутки экспрессия Ki-67 была максимальной у животных, получавших ЛХТ-7-17, как в самом эпителии, так и строме и составляла 10 и 50% соответственно (р=0,01 при сравнении с контролем). Это свидетельствует об увеличении количества клеток, готовящихся к делению и запуску процессов пролиферации и регенерации уже на ранних стадиях заживления раны. У животных контрольной группы данный показатель увеличивается лишь к 7-м суткам до 20 и 65% соответственно (рис. 4), статистически значимо превосходя значения, полученные для крыс опытной серии (р=0,001 при сравнении с опытной серией).

Для оценки роста и плотности кровеносных сосудов был использован маркер CD34. На рис. 5 показано, что экспрессия CD34 возрастала на 3-и сутки у животных, получавших ЛХТ 7-17, в среднем до 35% позитивно окрашенных клеток по сравнению с группой контроля (в среднем 18%; р=0,001). Это доказывает более раннее образование в опытной группе микрососудистого русла, необходимого для формирования грануляционной ткани (см. рис. 4). Эффект местного применения ЛХТ-7-17 сопоставим с таковым препарата сравнения на всех этапах регистрации экспрессии маркера неоангиогенеза.

Местное применение мягкой лекарственной формы серебряной соли N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (ЛХТ-7-17) приводит к ускорению пролиферативно-регенерационных процессов в плоской ране, активации васкуляризации раны, снижению активности воспалительного процесса, формированию рубца первичным натяжением и является перспективным веществом с регенеративной активностью в отношении хирургических ран.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.