Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Рак ободочной кишки и рак прямой кишки являются крайне разнородными заболеваниями со специфичными молекулярными особенностями [1]. При этом молекулярные подтипы характеризуются различным клиническим течением, прогнозом и подходами к терапии. Так, в настоящее время основными молекулярными маркерами колоректального рака (КРР) принято считать мутации генов KRAS, NRAS, BRAF, экспрессию или амплификацию HER2neu, а также микросателлитную нестабильность (MSI). Именно они в клинической практике выполняют прогностическую роль и являются предикторами ответа на терапию таргетными препаратами и ингибиторами контрольных точек иммунитета [2]. Несмотря на широкий спектр методов лечения КРР, зачастую заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение с развитием резистентности к различным видам лекарственной терапии и высокие показатели летальности. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов патогенеза КРР, роли микроокружения опухоли и опухолевых стволовых клеток (ОСК) в канцерогенезе, а также динамики внутриопухолевой гетерогенности в процессе развития опухоли и под влиянием конвенциональной терапии [3].

Изменение представлений о патогенезе колоректального рака

Основным положением модели колоректального канцерогенеза, описанного в работах D. Iyer [3], E. Fearon и B. Vogelstein [4], явилась моноклональность происхождения злокачественной опухоли в слизистой оболочке толстого кишечника. Это означает, что возникновение КРР связывали с клональной экспансией потомков одной бесконтрольно пролиферирующей клетки. Однако в настоящее время в исследованиях установлено, что в патогенезе КРР значимую роль играет существование ОСК. Концепция ОСК была разработана несколько десятилетий назад и описывала способность таких клеток инициировать образование опухоли, а также обусловливать резистентность к терапии. Выявлено, что ОСК имеет ряд общих черт с эмбриональными стволовыми клетками — они редко встречаются в общей популяции клеток, имеют медленный клеточный цикл, бесконечную способность к самовоспроизведению и используют схожие сигнальные механизмы. Теория существования ОСК обоснована тем, что опухолевая клетка обладает свойством пластичности и способна менять свои позиции в опухолевой иерархии, переходя из состояния стволовой клетки в дифференцированную и обратно. При этом на фенотип ОСК влияют генетические, эпигенетические факторы и опухолевое микроокружение, приводя к изменению состава клеток в процессе развития опухоли. Таким образом, ранее существовавшие взгляды на генетические мутации как главную причину опухолевой гетерогенности утратили свою актуальность [3]. Подтверждено, что клетки различных типов опухолей, в том числе и КРР, могут возникать из ОСК в культуре клеток в отсутствие терапевтического воздействия, индуцирующего генетические повреждения. Считается, что противоопухолевое лечение — химиотерапия и лучевая терапия — не только могут приводить к селекции резистентных клонов в опухоли, но также способны индуцировать приобретение дифференцированными раковыми клетками свойств ОСК. При этом агрессивное биологическое поведение опухолевых клеток, т.е. их способность к инвазии и миграции, может быть как изначальным свойством, так и появляться при нарастании гипоксии, метаболическом стрессе и в процессе лечения [5].

В ряде экспериментальных исследований на биологических моделях прослежены динамика содержания стволовых клеток в кишечном эпителии в зависимости от наличия ключевых мутаций, а также влияние генетических особенностей на развитие опухоли. Известно, что мутации в эпителии кишечника могут возникать в результате ошибок репликации ДНК, воздействия канцерогенов, а также на фоне воспаления. Предполагалось, что транзитные амплифицирующиеся (ТА) клетки в криптах эпителия кишечника наиболее подвержены мутациям. Однако, учитывая короткий промежуток жизненного цикла и некритичные типы обнаруженных мутаций, риск выступить инициатором опухолевого роста у мутированных ТА-клеток очень низкий [3]. Кроме этого, мутированная клетка может быть заменена диким типом стволовой клетки кишечника (СКК) ввиду особенностей ее деления и низкой частоты встречаемости в общей популяции клеток. В то же время потеря функции гена APC в пучковых клетках эпителия кишечника (tuft-клетки) может инициировать процесс канцерогенеза в определенных условиях микроокружения, например, при наличии воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника [6, 7]. Однако в большинстве случаев КРР является очень медленно развивающимся заболеванием вследствие длительности накопления пула мутированных клеток [6, 8, 9].

Крайне важно понимать, что генетические события в дифференцированной эпителиальной клетке способны привести к развитию КРР совместно с внешними факторами. На модели трансгенных мышей показано, что кишечные эпителиальные клетки могут подвергаться обратной дифференцировке в опухоль-инициирующие стволовые клетки под влиянием активации сигнала Wnt и воспалительного сигнального пути ядерного фактора NFκB (nuclear factor-kappa B). В частности, к запуску сигнального пути Wnt может привести накопление таких мутаций, как KRASG12D, активирующих воспалительный сигнальный путь, совместно с потерей функции гена APC. Это в свою очередь инициирует образование опухоли из дифференцированных клеток.

Таким образом, исследования свидетельствуют, что КРР может иметь происхождение как из первичной стволовой клетки кишечника, так и из дифференцированной. При этом к дополнительным факторам инициации и прогрессии, кроме накопления мутаций, относят и внешние факторы для обеспечения функционального преимущества мутированных клеток [6, 7].

Молекулярные маркеры и механизмы функционирования опухолевой стволовой клетки кишечника

Очевидно, что новые подходы к диагностике и терапии КРР следует разрабатывать с учетом анализа специфичных для СКК маркеров с целью установления прогениторных клеток рака и разработки стратегий таргетного воздействия. В исследованиях было показано, что в СКК, экспрессирующих маркеры Lgr5 (the leucine-rich repeat — containing G protein-coupled receptor 5), Lrig1 или CD133, отключение функции гена APC может индуцировать быстрый рост аденомы. Активация сигнального пути β-катенина, как и наличие экспрессии Bmi1, также приводила к развитию похожего сценария [10, 11]. Клиническое значение определения комбинаций наиболее изученных маркеров ОСК (CD133, CD166, CD44) заключается в возможности выделения подгрупп больных КРР, резистентных к терапии 5-фторурацилом (5-ФУ), имеющих высокий риск прогрессирования заболевания [3, 5, 12].

В процессе роста и поддержания пула ОСК играют роль сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP (костный морфогенетический белок). Канонический сигнальный путь Wnt регулирует стволовость, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [3]. Его активация приводит к ядерной транслокации β-катенина и транскрипции генов c-Myc, Axin2, Lgr5, и ASCL2, что определяет направление пролиферации и ведет к поддержанию фенотипа ОСК [12]. Сигнальный путь Wnt необходим для функционирования предшественников стволовой клетки в крипте и поддержания гомеостаза эпителия кишечника. Инактивирующие мутации гена APC и соответственно гиперактивация Wnt-сигнального каскада или активирующие мутации β-катенина идентифицированы как инициирующие факторы в канцерогенезе при КРР. Показано, что ОСК кишечника с эксперссией CD133 содержат субпопуляцию с активным Wnt-сигнальным путем, ядерной локализацией β-катенина и признаками ОСК. Внутриопухолевая гетерогенность по Wnt-сигнальному каскаду, обозначенная как «β-катениновый парадокс», свидетельствует о необходимости выделения роли мутаций KRAS, PI3K и сигнальных путей Notch и Hedgehog в образовании ОСК при КРР. Мутации участников сигнального пути Wnt обнаруживают более чем в ¹/₅ случаев КРР, зачастую совместно в инактивацией или делецией гена АРС. Совместно с потерей функции гена APC гуанозинтрифосфат (ГТФ) гидролаза RAC1 способствует накоплению ОСК, экспрессирующих Lgr5, при продукции активных форм кислорода. Это активирует NFκB-сигнальный путь, промотирующий Wnt-сигнальный каскад. Совместная активация NFκB-сигналинга и Wnt инициирует колоректальный канцерогенез путем дедифференцировки кишечного эпителия в стволовую клетку [13, 14].

Сигнальный механизм Notch активирован в популяции стволовых клеток крипт в отличие от дифференцированных клеток. Тем не менее Notch- и Wnt-сигнальные каскады поддерживают пролиферацию клеток аденомы в случае мутации АРС. Супрессия Notch-сигналинга вызывает остановку клеточной пролиферации в крипте и превращение клеток в дифференцированные секреторные бокаловидные клетки.

В дифференцированных клетках крипт активны Hedgehog- и BMP- сигнальные каскады. Кроме этого, при КРР также активированы гены, кодирующие участников сигнального каскада Hedgehog. Однако показано, что Gli-зависимый канонический Hedgehog-сигнальный путь вступает в антагонизм с Wnt-сигнальным путем, промотируя клеточную дифференцировку [3, 15, 16]. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGF-β/BMP тоже связан с Wnt-каскадом [3]. Выявлено, что BMP-сигнальный путь ингибирует Lgr5-позитивную стволовую клетку через Wnt-независимый сигнальный путь, что блокирует транскрипцию ключевых факторов поддержания стволовости ОСК [17]. Наличие герминальных мутаций рецептора 1-го типа BMP или его эффектора SMAD4 ассоциировано с высоким риском развития КРР. Кроме того, транскрипционный фактор GATA6 поддерживает пул Lgr5-позитивных РСК в аденоме, при этом супрессируя BMP-сигнальный путь путем блокады связывания β-катенин/TCF4 транскрипционного комплекса с регуляторным регионом локуса BMP4 в дифференцированных опухолевых клетках. В опытах in vivo выключение GATA6 приводило к повышению активности сигнального пути BMP, ингибируя развитие КРР.

Иммунное и стромальное микроокружение в патогенезе колоректального рака

Микроокружение опухоли характеризуется наличием экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов различным спектром иммунных клеток и стромальными клетками опухоли [18]. Существует определенный баланс между стимулами микроокружения к самообновлению и дифференцировке СКК и ОСК. Основная роль в регуляции этого процесса отводится компонентам стромы опухолевых клеток и растворимым факторам [19]. При КРР основной клеточной популяцией ниши ОСК является мезенхимальная стволовая клетка (МСК), которая продуцирует цитокины и хемокины (CXCL12), интерлейкины 6 и 8 (IL-6 и IL-8). Эти факторы активируют сигнальный путь NF-κB, регулирующий миграционные свойства и инвазивность ОСК, продукцию индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — Slug, Snail и Twist. ЭМП представляет собой критическую ступень в метастазировании и прогрессии рака, приводя к трансформации дифференцированной клетки в мезенхимальную [20].

Накоплено немало данных о высоком риске развития КРР при хронических воспалительных заболеваниях кишечника, в том числе при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Хроническое воспаление приводит к образованию миелоидных супрессивных клеток (MDSC) у пациентов с хроническим заболеванием кишечника. Накопление этих клеток в опухоли при воспалении приводит к снижению противоопухолевого иммунитета, провоцируя опухолевый рост. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) ответственны за активацию и поддержание процесса хронического воспаления. Локальное воспалительное микроокружение может приводить к накоплению генетических и эпигенетических повреждений. Далее опухолевый процесс также поддерживается воспалением, при котором цитокины и хемокины влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость раковых клеток. Тем не менее конкретные механизмы влияния воспалительного микроокружения на патогенез рака остаются непонятными. При этом очевидно, что канцерогенный и противоопухолевый эффекты воспаления детерминированы не только присутствием определенных цитокинов, но и временем экспозиции воспалительного стимула [19].

В случае прогрессирования КРР генетические и эпигенетические изменения, а также самообновление ОСК приводят к гетерогенности опухолевых клеток. При этом пластичность ОСК определяется характером стимулов микроокружения и подразумевает баланс между переключением стволового и дифференцированного состояния за счет процесса ЭМП. Основная роль в этом процессе клеточного репрограммирования в ОСК отводится цитокинам. Опухолевые и стромальные клетки выделяют ростовые факторы, хемокины, факторы ангиогенеза, интерфероны и другие растворимые факторы [19—21]. Как ранее показано, сигнальный путь Wnt/β-catenin является наиболее значимым сигнальным путем, вовлеченным в стволовость. Активируют Wnt-сигнальный путь несколько цитокиновых рецепторов. В исследовании L. Vermeulen и соавт. [22] продемонстрировано, что секретируемый миофибробластами фактор роста гепатоцитов (HGF) индуцирует стабилизацию β-catenin путем связывания с рецептором HGF/c-Met. В работе H. Li и соавт. [23] показано, что секретируемый клетками КРР IL-1 запускает продукцию простагландина E2 МСК. Он активирует Akt-сигнальный механизм, что ведет к ядерной локализации β-catenin, индуцируя ЭМП и инвазивность клеточных линий КРР. Кроме этого, под влиянием IL-1 МСК продуцируют цитокины и хемокины IL-8 и IL-6, также вовлеченные в приобретение стволовых ствойств клетками КРР.

На самообновление клеточной популяции ОСК также способны влиять иммунные клетки — макрофаги, T-регуляторные лимфоциты и T-эффекторы [24]. I. Kryczek и соавт. [25] показали, что CD4+ T-клетки секретируют IL-22 и активируют транскрипционный фактор STAT3, который участвует в функционировании основных генов стволовости Nanog и Sox2. Также МСК, эндотелиальные, эпителиальные и раковые клетки секретируют IL-8, вовлеченный в процессы ЭМП, ангиогенез, опухолевый рост, метастазирование и формирование иммуносупрессивного микроокружения [26]. Аутокринно и паракринно IL-8 воздействует на активацию специфичных сигнальных путей (Snail, Slug, Akt и MAPK-каскад) и индуцирует продукцию макрофагальных паракринных факторов (TGF-β, EGF, IL-6, IL-1β и (MMP)-2/-9) [27]. W.L. Hwang и соавт. [28] показали, что ось Snail-IL-8 регулирует свойства стволовости популяции CD44+ клеток КРР. В своей работе авторы проанализировали транскриптомный профиль клеток первичной опухоли КРР, которые характеризовались высокой экспрессией Snail, IL-8, VEGF и низкой — E-кадгерина. Показана корреляция Snail и IL-8 с экспрессией CD44. Роль Snail-индуцированной секреции IL-8 заключается в промотировании стволовых свойств. Это доказано снижением экспрессии генов стволовости и химиорезистентности при воздействии нейтрализующего антитела к IL-8 [28, 29].

Ген Oct4 также влияет на повышение уровня ИЛ-8, как показано в исследовании C. Chang и соавт. Высокий уровень экспрессии гена Oct4 в клетках ассоциирован с экспрессией маркеров стволовости (CD133, CD44, Snail, Sox2 и Nanog). Кроме этого, клетки с высокой экспрессией Oct4 секретируют IL-8 и IL-32, индуцируя опухолевую прогрессию КРР. Переход в стволовое состояние клеток при КРР способны ингибировать антитела к IL-8 и IL-32 [30]. В исследовании J. Carpentino и соавт. [31] выявлены высокие уровни IL-8 в микроокружении опухоли и уменьшение объема опухоли на ксенографтах после блокады IL-8. ОСК КРР in vitro пролиферируют в ответ на влияние IL-8 в дозозависимой манере. При этом ингибирование секреции IL-8 или блокирование его рецептора CXCR1 приводило к нарушению клеточного цикла, остановке пролиферации и ингибированию ангиогенеза. Похожие результаты получены на ксенографтах мышей [32].

Исследователи S. Fang, X. Fang и M. Shimizu и N. Tanaka [33, 34] показали, что при КРР IL-8 индуцирует захват глюкозы и реализацию эффекта Варбурга, что также влияет на стволовость клетки. Так, IL-8 индуцирует экспрессию глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазы и промотирует O-ацетилглюкозаминирование (O-GlcNAcylation), индуцируя ЭМП и повышая метастатический потенциал. Ингибитор O-GlcNAcylation OSMI1 уменьшает популяцию ОСК посредством снижения активности мРНК Sox2 и его протеина [35].

Сигнальный путь IL-6/STAT3 играет важную роль в патогенезе воспалительной формы КРР. IL-6 влияет на нисходящий сигнал STAT3, провоцируя быструю активацию c-Myc путем связывания с комплексом транскрипционного фактора E2F и промотора c-Myc. На модели мышей показано, что в этом случае при иммуногистохимическом окрашивании слизистой оболочки кишечника выявлено увеличение экспрессии c-Myc, HK2, PFK, PKM2 и pho-STAT3. Значительно увеличилось количество ключевых метаболических ферментов, как LDH-A и PKM2, играющих значимую роль в поздних стадиях аэробного гликолиза при хроническом колите. Продукция IL-6 повышает экспрессию ферментов гликолиза, продукцию лактата и вызывает пролиферацию клеток при КРР. Таким образом, при хроническом воспалении происходит метаболическое репрограммирование с инициацией канцерогенеза. Кроме этого, IL-6 ингибирует поздний апоптоз клеток, индуцированный 5-фторурацилом [36]. Интересны данные о влиянии онкогенов KRAS и BRAF на протеомные изменения в метаболических путях, которые ассоциированы с эффектом Варбурга при КРР. Метаболическое репрограммирование, вызванное онкогенными KRAS и BRAF, манифестирует нарушениями гликолиза, биосинтеза серина и утилизации глутамина. При КРР эти мутации ассоциированы с высоким индексом пролиферации, однако могут иметь и отношение к фенотипу рака [37].

Более 50% клеток, инфильтрирующих опухоль, является макрофагами. Привлечение в очаг и накопление ОАМ инициировано хемоаттрактантами (CCL2/MCP-1, CSF-1), что запускает опухолевую прогрессию. Поляризация макрофагов определяется микроокружением и приводит к продукции различных цитокинов и хемокинов. M1-фенотип активирован при остром воспалении лигандами TLR или цитокинами Th1 (IFNγ, TNFα) и продуцирует провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23), активные формы кислорода, оксид азота и антигены главного комплекса гистосовместимости II (MHC II). Появление M2-фенотипа опосредовано цитокинами IL-4/IL-13, IL-10, TGFβ или глюкокортикоидами. M2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины (IL-10, TGFβ), ингибируя цитотоксические CD8+ T-клетки. Также эти макрофаги продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, приводят к его ремоделированию, иммунной толерантности, способствуя опухолевому росту. На образование M1-макрофагов влияют транскрипционные факторы IRF3, IRF5, STAT1, и STAT5, на M2-фенотип — IRF4, STAT3 и STAT6 [38]. Интерес также представляют miR127, miR155, и miR223, являясь ключевыми регуляторами поляризации M1-макрофагов, а miR146-a промотирует M2- поляризацию [39—41].

В исследовании Y. Zhang и соавт. [42] МСК, изолированные из опухоли КРР, имели многолинейный потенциал дифференцировки. Они повышали стволовость и миграционные свойства клеток КРР in vitro, вызывали рост и метастазирование КРР in vivo. Клетки КРР, находящиеся в кондиционированной среде МСК, также имели большую миграционную способность, что связано с секрецией ИЛ-6. Промотирующая способность МСК КРР к метастазированию подтверждена in vivo, вызывая ангиогенез, ЭМП.

Выявлено, что при последовательном переходе от аденомы к карциноме при КРР происходят изменения состава микробной флоры в сравнении с контрольной группой здоровых людей. Определенные типы бактерий могут влиять на иммунную систему, приводя к накоплению иммунокомпетентных клеток Th17 или Treg в слизистой оболочке кишечника. Кроме того, комменсалы или патогенные виды бактерий индуцируют различные иммунные ответы и синтез цитокинов в эпителиальных клетках кишечника. Нарушения микробиоты запускают продукцию эпителием кишечника IL-17C, промотируя канцерогенез. Опухоли кишечника зачастую покрыты микробными биопленками, что коррелирует с повышенной активацией сигнальных каскадов IL-6 и STAT3. Синтезируемый бактериями бутират индуцирует образование IL-18 в кишечном эпителии. К тому же кишечная микробиота может влиять на эффективность противоопухолевой иммунотерапии, контролируя функционирование дендритных клеток и последующую активацию противоопухолевых T-клеток [43].

Клиническое значение выделения иммунных и стромальных подтипов колоректального рака

Недавно предложена новая классификация КРР по молекулярным подтипам, основанная на данных транскриптомного анализа, которая стратифицирует КРР на группы с различным прогнозом (CMS1, CMS2, CMS3, CMS4). Подтип CMS1, MSI-подобный вариант, объединяет опухоли с микросателлитной нестабильностью (МСН) и мутациями в генах репарации неправильно спаренных нуклеотидов ДНК, что приводит к высокой мутационной нагрузке. Также MSI-подобный подтип включает опухоли с метилированными CpG-островками (CIMP) и мутациями в онкогене BRAF. Подтип CMS2 характеризуется хромосомной нестабильностью (CIN) и активацией сигнальных путей Wnt и MYC. Подтип CMS3 объединяет опухоли с мутациями KRAS и демонстрирует нарушение в метаболических путях. Подтип CMS4 имеет мезенхимальный фенотип и зачастую демонстрирует метилирование CpG-островков [44]. При анализе корреляции подтипов молекулярной классификации с иммунным и стромальным компонентом установлено, что мезенхимальные опухоли ассоциированы с провоспалительным, проангиогенным и иммуносупрессивным микроокружением. Высокая экспрессия генов иммунного ответа характера для подгрупп CMS1 и CMS4. Подтип CMS1 (MSI-подобная группа) имела благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости, а мезенхимальный тип опухоли (CMS4) был предиктором наихудшего исхода [44—47]. Установлено, что опухоли с наличием MSI характеризуются высокой инфильтрацией T- и B-лимфоцитов, а также экспрессией генов, кодирующих хемоаттрактанты T- и B-лимфоцитов (CXCL9, CXCL10, CXCL13) [45, 48—51]. При мезенхимальном фенотипе (CMS4) опухоли наблюдается инфильтрация стромальными фибробластами, при этом активация сигнального пути TGFß увеличивает способность опухоли к метастазированию на ксенографтах мышей [52, 53]. Выраженный воспалительный компонент уменьшает соотношение CD4+/CD8+ T-клеток (иммунорегуляторный индекс) в опухоли, снижая противоопухолевую активность цитотоксических T-лимфоцитов, вызывая рост опухоли, ангиогенез, ремоделирование стромы [53, 54]. Учитывая роль активного стромального и иммунного микроокружения, возможно, при мезенхимальном типе КРР необходимо модулировать данный компонент опухолевой ткани. Несмотря на высокий уровень CD8+ T-лимфоцитов, наличие воспалительного микроокружения при мезенхимальном подтипе ассоциировано с ингибированием T-цитотоксического компонента, вероятно, за счет нарушений механизма привлечения дендритных клеток.

Подтип CMS 1 (MSI-подобный) является высокоиммуногенной группой КРР, ассоциированной с высоким уровнем инфильтрации CD8+T-лимфоцитов и благоприятным прогнозом. Пролиферация T- и NK-клеток при этом типе основана на высокой экспрессии гена MHC I и генов цитотоксических лимфоцитов, хемоаттрактантов T-клеток памяти (CXCL9 или CXCL10) [45, 46, 49—51, 55, 56]. IFNg, продуцируемый инфильтрирующими T-клетками, вызывает резистентность, увеличивая экспрессию на T-клетках PD-1 и его лиганда CD274. Это приводит к неэффективной противоопухолевой активности T-лимфоцитов, что открывает перспективы использования анти-PD-1/PD-L1-терапии при MSI-подобных опухолях [57—61]. Кроме опухолей с микросателлитной нестабильностью (MSI), MSI-подобный фенотип включает также некоторые варианты опухоли с микросателлитной стабильностью (MSS) [62].

Подтипы КРР CMS2 и CMS3 характеризуются низкой инфильтрацией иммунными клетками и экспрессией MHC I, вследствие чего являются низкоиммуногенными [63, 64]. Ввиду того, что транскриптомная классификация КРР ассоциирована с различными иммунными и стромальными компонентами, формируется необходимость в новой классификации опухолей КРР с учетом иммунного и стромального микроокружения опухоли. При этом очевидно, что молекулярная классификация поможет выделить дополнительную группу пациентов, которым показано назначение иммуноонкологических препаратов.

Влияние стандартных методов терапии на повышение стволовых свойств опухоли

В процессе лечения при воздействии на дифференцированную популяцию клеток вне зависимости от изначального процента РСК опухоль становится резистентной к лекарственной терапии и облучению, провоцируя прогрессирование и рецидив заболевания. Отсутствие чувствительности ОСК к этим методам терапии обусловлено повышенной экспрессией ABC-транспортеров, активным восстановлением ДНК и устойчивостью к апоптозу [65]. Кроме этого, маркеры ОСК Lgr5, CD44 и ALDH1 ассоциированы с низкой безрецидивной выживаемостью при II и III стадии КРР после лечения фторпиримидинами [66]. Необходимо понимать, что традиционная адъювантная терапия при использовании фторпиримидинов и/или платиносодержащей схемы при КРР приводит к резистентности и рецидивам по причине накопления пула ОСК. При нерезектабельном КРР применение схемы mFOLFOX6 способствует повышению уровня экспрессии маркеров ОСК в отдаленных метастазах [67, 68]. На ксенографтах КРР обнаружено накопление резистентной субпопуляции ОСК с повышенным уровнем ALDH1 при воздействии циклофосфамида или иринотекансодержащей схемы, что может привести к рецидиву. ОСК может приобретать резистентность к терапии ввиду способности к фенотипической пластичности. S. Kobayashi и соавт. [69] выявили возможность перехода Lgr5+ ОСК из пролиферирующего состояния в фазу покоя (Lgr5-фенотип ОСК) после проведения противоопухолевого лечения. После окончания химиотерапии клетки без экспрессии Lgr5 снова переходят в состояние Lgr5+, при этом в любом состоянии эти клетки могут инициировать образование опухоли. Резистентность к терапии и способность к рецидивированию регулируются микроокружением при воздействии на ключевые сигнальные пути с помощью эпигенетических модификаций. Например, опухолеассоциированные фибробласты секретируют цитокины и хемокины, которые промотируют пролиферацию ОСК, резистентных к апоптозу, в ответ на терапию моноклональными антителами к эпидермальному фактору роста (EGFR) [70,71]. Гиперактивация сигнального механизма Wnt, необходимого для роста и развития стволовых клеток, наблюдается при резистентности КРР к 5-фторурацилу [72]. При этом восстановление чувствительности к лучевой терапии в случае резистентности к 5-ФУ возможно при инактивации транскрипционного Wnt-зависимого фактора TCF-4 [71].

Заключение

Понимание биологических основ инициации канцерогенеза в условиях высокой заболеваемости КРР весьма важно с позиции профилактики и лекарственной терапии. В исследованиях показана значимая роль хронического воспаления в дедифференцировке эпителия и канцерогенезе КРР. Определенный клеточный состав микроокружения опухолевой ниши, вероятно, зависит от этиопатогенеза рака на начальных этапах развития опухоли. Изначально этим обусловлено свойство стволовости опухоли. Однако по мере роста опухоли и влияния специальных методов терапии происходят изменения в микроокружении и цитокиновом профиле опухоли, что провоцирует пластичность опухолевых клеток. В связи с этим серьезный интерес для клинической медицины представляют данные о различных источниках происхождения опухолевых стволовых клеток, их маркерах и функционировании, возможности дедифференцировки эпителия и механизмах, приводящих к пластичности опухолевой стволовой клетки в процессе развития опухолевого процесса. Ведутся разработки стратегий лекарственного воздействия на опухолевую стволовую клетку и пластичность раковых клеток, а также изучаются комбинации этих методов с конвенциональной терапией для повышения эффективности лечения КРР.

В свете классических подходов к терапии рака все больше данных указывает на то, что уменьшение размера опухолевой ткани не коррелирует с уменьшением количества опухолевых стволовых клеток. При этом в агрессивных опухолях конвенциональная терапия увеличивает воспалительную реакцию опухолевого микроокружения и способствует резистентности при накоплении пула опухолевых стволовых клеток. Свойство пластичности опухолевой стволовой клетки в дальнейшем реализуется превращением ее обратно в опухолевую эпителиальную клетку. Таким образом, влияние на опухолевые стволовые клетки более оправдано при их циркуляции в кровеносном русле ввиду отсутствия микроокружения. Тем не менее при наличии первичной опухоли и метастатическом процессе эффективное лечение КРР должно включать способы воздействия на опухолевое микроокружение. В будущих исследованиях могут быть определены молекулярные подтипы КРР с различными клеточным составом, реакцией стромы опухоли и цитокиновым профилем для оптимизации стратегий терапии заболевания согласно этиопатогенетическим подтипам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.