Последнее время все больше внимания уделяется микроокружению опухоли как фактору, влияющему на прогрессию и развитие рака. К микроокружению опухоли (составляющим десмопластической стромы) относят внеклеточный матрикс, гладкомышечные клетки, сосуды, иммунные клетки и опухолеассоциированные фибробласты (CAF) [1]. Возможность создания и внедрения препаратов лекарственной противоопухолевой терапии, нацеленных на контрольные точки не только атипичных опухолевых клеток, но и клеток десмопластической стромы, на их сигнальные пути, является самым перспективным и современным вектором онкологических исследований. Работ, посвященных различиям иммунного микроокружения в раках разной локализации, достаточно, на основе исследований разработаны таргетная иммунотерапия, а также новые диагностические тесты. Препараты-ингибиторы контрольных иммунных точек эффективно блокируют опухолевую прогрессию, снижая риск рецидивов и улучшая клинический прогноз пациентов. Работ, посвященных роли CAF в разных опухолях, намного меньше, а таргетные препараты на сегодняшний день отсутствуют [2]. Помимо малого количества исследований, посвященных роли CAF в различных опухолях в принципе, другой проблемой является гетерогенность CAF как внутри одной локализации, так и при разных локализациях. Также сложностей добавляет отсутствие единого маркера, идентифицирующего CAF во всех раках: это приводит к невозможности использования результатов, полученных на одной локализации, в другой и свидетельствует об отсутствии понимания о схожести биологии CAF в опухолях разной локализации.

Рак мочевого пузыря (РМП) является 10-м по распространенности онкологическим заболеванием в мире: в 2022 г. число пациентов достигло 573,3 тыс. [3]. Рак простаты (РП) занимает 5-е место в структуре смертности во всем мире, а в 48 странах — первое место. В мужской популяции РП — второе по частоте злокачественное заболевание, в 2020 г. было зарегистрировано более 1,41 млн новых случаев в мире [4].

CAF во многом отличаются от покоящихся фибробластов, находящихся в нормальных тканях: они крупнее, веретенообразной формы с разветвленной (branching) цитоплазмой метаболически активные. К маркерам, которые традиционно описываются как маркеры CAF, относят FAP (fibroblast activated protein), FSP1 (fibroblast specific protein), a-SMA (smooth muscle actin), PDGFR-α, β (platelet derived growth factor receptor-alpha and –beta), POSTN (periostin) [2, 5]. Раньше использовался термин «активированные» фибробласты (синоним миофибробласты), который подразумевал фибробласты, активно экспрессирующие αSMA, однако в настоящее время признано, что группа CAF гетерогенна и CAF, продуцирующие αSMA (αSMA⁺CAF или myCAF), являются лишь одной из субпопуляций, продуцирующих и ремоделирующих межклеточный матрикс; myCAF описаны в раке поджелудочной железы и РМП [6, 7]. В раке поджелудочной железы, помимо myCAF, описан воспалительный кластер CAF (iCAF), который впоследствии удалось выявить и в мочевом пузыре [6, 7]. Наряду с myCAF существует еще множество субпопуляций. Например, в работе [8] по исследованию РП выявлено 8 субпопуляций, 2 из которых имели клиническое значение, в раке молочной железы описаны 4 подтипа CAF (CAF S1-S4), один из которых соответствует myCAF [9].

FAP — поверхностный гликопротеин с пептидазной и высокой коллагенолитической активностью, экспрессируемый на поверхности CAF, окружающих опухолевые эпителиальные клетки в разных карциномах, в том числе они описаны в слизистой оболочке полости рта, пищевода, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, простаты, почки и др. [10]. Есть данные о взаимосвязи высокой экспрессии FAP с плохой общей выживаемостью и метастазами в лимфатических узлах в солидных опухолях (желудок, легкое, толстая кишка, пищевод, мочевой пузырь) [10].

Маркер PDGFR, состоящий из двух фракций (α и β) в разных публикациях используется как маркер разделения caf на две и более субпопуляций. Так, PDGFRα используется для обозначения субпопуляции iCAF в РМП [6] и CAF-S2 в РП [11]; PDGFRβ маркирует CAF-S3 в раке молочной железы [12] и CAF-S1 — в РП [11]. Есть данные о корреляции между низким уровнем стромального PDGFRα и увеличением опухолевой прогрессии в раке молочной железы [13] и между высокой экспрессией PDGFRβ и плохим прогнозом при раке яичника и колоректальном раке [14] и резистентностью к терапии тамоксифеном при раке молочной железы [15].

Цель работы — оценить реакцию маркеров CAF — FAP и PDGFR_α+β в раке мочевого пузыря и раке простаты.

Материал и методы

В работе использован операционный материал, полученный от 34 пациентов с РП и 44 пациентов с РМП. Возраст пациентов с РМП варьировал от 36 до 82 лет (средний 61,8 года), с РПЖ — от 52 до 77 лет (средний 64,05 года). Клинико-морфологические характеристики представлены в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-морфологические характеристики операционного материала

Иммуногистохимическое исследование проведено в автоматическом режиме в автостейнере BOND-III с двумя антителами: кроличьи моноклональные (Y92) PDGFR_α+β (ab32570) и кроличьи моноклональные (EPR20021) FAP (ab207178). Депарафинирование осуществляли с помощью Bond Dewax Solution, демаскировку антигенов — при помощи раствора для высокотемпературной демаскировки Bond Epitope Retrieval-2. В качестве системы детекции использовали Bond Polymer Refine Detection.

В РМП реакцию с PDGFR_α+β оценивали полуколичественным методом отдельно в строме сосочковых структур и в базальных слоях опухоли/инвазивном крае. Интенсивность реакции регистрировали в заявленной зоне в баллах (0 — отсутствует, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная). FAP оценивали по той же шкале, но без разделения на зоны.

В раке простаты PDGFR_α+β определяли вокруг опухолевых комплексов. Оценивали интенсивность реакции в заявленной зоне также в баллах (0 — отсутствует, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная). FAP определяли по той же шкале.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета Statistica 12 (StatSoft Inc., США). Оценку соответствия вида распределения нормальному проводили с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для всех переменных было установлено, что распределение отлично от нормального. Для множественного сравнения трех групп и более использовали непараметрический критерий Краскела–Уоллиса; для попарного сравнения групп, в том числе для апостериорного сравнения, — непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для анализа качественных признаков использовали таблицы сопряженности, значимость различий для таблиц сопряженности 2×2 устанавливали с использованием точного критерия Фишера, для таблиц с большей размерностью — критерий χ²). Пороговый уровень значимости (p) во всех случаях считали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Количественную оценку окрашенных микропрепаратов проводили независимо два врача патологоанатома для достижения более объективного значения.

Реакцию PDGFR_α+β в простате оценивали в строме вокруг опухолевых желез, а также (для сравнения) в интактной строме вокруг желез. Было отмечено, что вокруг неопухолевых желез реакция PDGFR_α+β также присутствовала, особенно вокруг крупных протоков и зоне базально-клеточной гиперплазии. Вокруг атрофичных желез, а также в периуретральной зоне реакции не наблюдалось. Реакция FAP вне опухолевых комплексов в основном отсутствовала, за исключением крупных протоков, содержащих секрет.

В мочевом пузыре реакция PDGFR_α+β наблюдалась во всех папиллярных раках в строме сосочков (предположительно реакция выявлялась в эндотелии сосудов, что является нормой для PDGFR). Реакция FAP выявлялась преимущественно в базальных отделах образований и инвазивном крае опухоли. Реакция маркеров в нормальной ткани мочевого пузыря не оценивалась в связи с отсутствием таковой в препаратах (был использован материал после операций en block).

Распределение реакций в опухолях мочевого пузыря показано в табл. 2 и на рис. 1. Реакция FAP наблюдалась только в инвазивных раках (p=0,0094), и достоверно чаще — в раках с high grade дисплазией (p=0,0000234). Это согласуется с недавним исследованием [16], где было показано, что FAP является одним из неблагоприятных стромальных маркеров CAF рака мочевого пузыря. FAP также описан как плохой прогностический маркер при колоректальном раке, раке яичников и поджелудочной железы [17—19]. В экспериментальных моделях показано, что FAP-позитивные фибробласты обладают иммуносупрессивными функциями [9, 20], в связи с чем может быть интересным дальнейшее исследование микроокружения РМП и уровня экспрессии FAP с позиции дальнейшей БЦЖ-терапии.

Таблица 2. Интенсивность реакции исследуемых маркеров при раке мочевого пузыря

Примечание. Здесь и в табл. 3: n — число случаев.

Рис. 1. Реакция PDGFR_α+β и FAP в опухолях мочевого пузыря.

Экспрессия PDGFR_α+β: а — в сосочках папиллярного рака; б — реакция 1+ в основании опухоли; в — реакция 3+ в основании опухоли. Экспрессия FAP: г — отрицательная реакция в основании опухоли; д — реакция 2+ в основании опухоли; е — реакция 3+ в основании опухоли. Иммуногистохимическая реакция, ×200.

Также есть исследование [8], показывающее, что у пациентов с меланомой и уротелиальной карциномой, не отвечающих на иммунотерапию анти-PD-L1, уровень CAF, экспрессирующих FAP (CAF-C1), значительно выше, это указывает на то, что CAFs-C1 участвуют в механизмах резистентности к лечению ингибиторами иммунных контрольных точек, а значит, являются диагностически значимыми маркерами.

Реакция PDGFR_α+β в инвазивном крае во всех случаях была положительная, но отличалась по интенсивности. Связи между grade (p=0,21112), уровнем инвазии (p=0,2757) и интенсивностью PDGFR_α+β выявлено не было. Это отчасти согласуется с исследованием [16], где не установлено связи между PDGFRα и стадией/grade РМП, а также с исследованиями при раке молочной железы, в которых фибробласты, экспрессирующие PDGFR_a, наблюдались в нормальной ткани и были расценены как резидуальные, ассоциированные с хорошим прогнозом.

При этом в исследовании [16] при РМП обнаружена выраженная корреляция между реакцией PDGFR_β и стадией/grade, а также 5-летней выживаемостью. Учитывая, что в нашем исследовании использовалась смесь маркеров, отсутствие статистической корреляции представляется логичным.

Распределение интенсивности реакций в опухолях простаты показано в табл. 3 и на рис. 2. В большинстве случаев реакция FAP оказалась отрицательной (52,94%), в остальных случаях слабоположительной и умеренной. Связи между выраженностью реакции и стадией (p=0,2587) и с уровнем по Глисону (p=0,0745) выявлено не было. Установлена связь с наличием метастазов (p=0,0239): в группе N1 реакция FAP оказалась значимо более выраженной).

Таблица 3. Интенсивность реакции исследуемых маркеров у пациентов при раке простаты

Рис. 2. Реакция PDGFR_α+β и FAP в опухолях простаты.

Экспрессия PDGFR_α+β: а — реакция в интактных железах; б — реакция 1+ в опухоли; в — реакция 3+ в опухоли. Экспрессия FAP: г — отрицательная реакция в опухоли; д — реакция 2+ в опухоли; е — реакция 3+ в опухоли. Иммуногистохимическая реакция, ×200.

По данным литературы [8], CAF, экспрессирующие FAP (в литературе именуются CAF-C1), являются плохим прогностическим фактором и ассоциированы с низкой общей выживаемостью при разных локализациях: раке мочевого пузыря (TCGA-BLCA), светлоклеточном раке почки (TCGA-KIRC), аденокарциноме желудка (TCGA-STAD), мезотелиоме (TCGA-MESO), меланоме (TCGA-SKCM) и раке простаты (TCGA-PRAD).

В случаях с отслеженным (5-летним) прогнозом выявлена сильная связь (p=0,023) между наличием рецидива и выраженностью реакции PDGFR_α+β (в случаях без рецидива реакция PDGFR_α+β была слабее): в группе с выраженной реакцией PDGFR_α+β (3⁺) значимо больше рецидивов по сравнению с группой 1⁺ (точный критерий Фишера для этого апостериорного сравнения p=0,0018). Связи между наличием рецидивов и выраженностью реакции FAP (независимо от ее интенсивности) не выявлено (p=0,1225).

Реакция PDGFR_a+b в опухоли во всех случаях была положительная, но отличалась по интенсивности. В случаях с метастазами (N1) реакция была более выражена, однако статистически различия не подтвердились (p=0,1272).

Многочисленные исследования показывают, что CAF включают несколько гетерогенных подмножеств клеток, однако специфические молекулярные особенности и биологические функции подмножеств CAF во время формирования и прогрессирования опухоли остаются плохо изученными и сильно различаются в зависимости от гистологического типа и локализации опухоли. Более того, все больше исследований показывает, что только определенные подгруппы CAF участвуют в прогрессировании опухоли, а воздействие на все типы CAF приводит к ускорению развития некоторых опухолей [21, 22].

Есть исследования, демонстрирующие, что стандартная терапия, нацеленная на опухолевые клетки без учета возможного повреждения микроокружения опухоли, может быть неэффективна в связи с влиянием CAF. Так, например, при колоректальном раке воспалительные фибробласты (iCAF) связаны с плохим ответом на химиолучевую терапию: химиотерапия способствует приобретению фибробластами воспалительного фенотипа, окислительному повреждению ДНК, приводящему к «старению» фибробластов, что вызывает резистентность к терапии и прогрессирование заболевания [23].

Недавние исследования выявили αSMA⁺ и FAP⁺ CAF с противоположными функциями при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. Показано, что αSMA⁺ CAF могут сдерживать прогрессирование опухоли за счет выработки коллагена I типа, а истощение αSMA+CAF приводит к более агрессивной опухоли и ухудшает выживаемость [21]. Напротив, FAP+CAF могут способствовать прогрессированию опухоли, а истощение FAP+CAF приводит к подавлению опухоли и улучшению выживаемости [24].

Заключение

Полученные результаты подтверждают гетерогенность CAF в опухолях мочевого пузыря и простаты. Показано усиление реакции FAP в опухолях простаты с наличием метастазов, значимо большее количество рецидивов в группе с выраженной реакцией PDGFR_α+β (3⁺); наличие реакции FAP только в инвазивных раках мочевого пузыря и раках мочевого пузыря с high grade дисплазией, это свидетельствует в пользу того, что FAP — маркер одной из субпопуляций CAF. Принимая во внимание данные литературы, что FAP экпрессируется в популяции CAF, приводящей к резистентности при лечении ингибиторами иммунных контрольных точек меланомы, маркер FAP может являться диагностически значимым маркером и для опухолей мочеполовой системы, особенно учитывая факт лечения опухолей мочевого пузыря вакциной БЦЖ. Данное предположение заслуживает дополнительных исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Олейникова Н.А.

Сбор и обработка материала — Сычева И.Н., Жестков И.А., Варенцов М.Г.

Статистическая обработка — Михайлов И.А.

Написание текста — Олейникова Н.А.

Редактирование — Мальков П.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.