Рак молочной железы (РМЖ) — одно из наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний, занимающих 1-е место (20,8%) среди всех новообразований у женского населения [1].
Своевременная диагностика, выявляющая злокачественное новообразование на ранней стадии, позволяет увеличить срок выживаемости, повысить эффективность лечения и улучшить прогноз течения заболевания.
В последние годы методы лечения злокачественных новообразований претерпели значительную эволюцию. Углубленное изучение механизмов канцерогенеза и возможных путей воздействия на его этапы привело не только к появлению новых высокоэффективных препаратов, но и целого направления — молекулярно-ориентированной терапии. И если в начале 90-х годов ХХ века применялись только химиотерапия и гормональные препараты, то в настоящие время с развитием генетики и появлением новых знаний о молекулярно-генетической природе опухолей методы терапии значительно расширились и дополнились узконаправленными таргетными методами лечения [2].
С каждым годом растет число публикаций, связанных с выявлением новых молекулярных нарушений и разработкой специфичных к ним препаратов. Если в 2005 г. число таких биомаркеров было единичным, то на сегодняшний день уже известно около 700 соединений для 150 мишеней, исследования в этой области продолжаются [4]. Такая общность маркеров для разных новообразований была взята за основу исследования MOSCATO, в котором было высказано предположение, что тестирование большого количества генов для всех типов опухолей может улучшить результаты у пациентов с трудно поддающимся лечению распространенным раком [4]. Было исследовано 1035 опухолей методом высокопроизводительного секвенирования. В результате показано, что выживаемость без прогрессирования увеличилась на 30% у трети пациентов по сравнению с группой, получавшей нетаргетную терапию. У 62% пациентов наблюдался частичный или полный ответ [5]. Определение молекулярно-генетического профиля опухоли дает возможность назначить соответствующую таргетную терапию и приводит к увеличению общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования [6].
В настоящее время существует широкий спектр таргетных препаратов, применяемых в зависимости от типа генетических нарушений и типа опухоли. В частности, в России зарегистрировано около 35 таргетных препаратов, используемых для лечения солидных опухолей, молекулярными маркерами для которых служат патогенные мутации в генах: KIT, PDGFRβ, VEGFR1/2/3, EGFR, ALK, PIGF, VEGFA/ B, VEGF, RET, VEGFR2, BRAF, PTCH, RANKL, ABL, FLT3, MET, RET, MEK, ROS1, CDK4, CDK6, RAF, PIK3CA, BRCA, CKIT, AR.
На данный момент идентифицировано множество молекулярно-генетических нарушений, связанных с развитием РМЖ. К наиболее часто встречаемым, по данным разных источников, относят: PIK3CA, TP53, ERBB2, FGF19, ESR1, ATM, FGFR1,3, PTEN, AR, FOXA1, ERBB4, GRB7, PDGFR, ABL, ALK, CDKN2B, EGFR, MET, INPP4B, IKBKE, STK11, NF1, CCND1, MYC, AKT1, PALB2, BRCA1,2, AKT3, KRAS, ARID1A [8, 9].
Цель исследования — оценить частоту встречаемости молекулярных нарушений, выявляемых в образцах опухолей у пациенток с местно-распространенным и метастатическим РМЖ методом NGS с последующим использованием результатов при выборе тактики лечения.
Материал и методы
В исследование включено 78 образцов, полученных от пациенток с диагнозом РМЖ в возрасте от 31 года до 87 лет (средний возраст 54±11,9 года). Критерии включения в исследование: гистологически подтвержденный РМЖ, возраст старше 18 лет, стадии согласно TNM-классификации, T3 N любая M любая, T любая N1-3 M любая, T любая N любая M1. Критерии исключения: возраст младше 18 лет, первичные новообразования другой локализации. Все образцы опухолевой ткани, полученные в ходе операции либо Core-биопсии, представляли собой парафиновые блоки. Клинические характеристики пациенток представлены в табл. 1.
Таблица 1. Клиническая характеристика пациенток
| Характеристика | Значение |
| Возраст, годы | 54±11,9 |
| ГП+ HER2– | 46 |
| ГП+ HER2+ | 13 |
| ГП — HER2– | 12 |
| ГП — HER2+ | 5 |
| Стадия опухоли согласно TNM-классификации: | |
| Т1 | 17 |
| Т2 | 34 |
| Т3 | 7 |
| Т4 | 20 |
| М0 | 67 |
| М1 | 11 |
Примечание. ГП-гормонопродуцирующая опухоль.
Выделение ДНК
Выделение ДНК из опухолевой ткани, залитой парафином, проводили с помощью наборов AVENIO Tumor Isolation and QC Kit (Roche, США), контроль качества выделенной ДНК — методом ПЦР, концентрацию измеряли на флуориметре Qubit 2.0 (Life techonologies).
Секвенирование таргетной панели
Библиотеки из выделенной ДНК получали с использованием набора AVENIO Tumor Library Prep Kit (Roche, США). Баркодирование библиотек проводили методом ПЦР при помощи наборов AVENIO Tumor Sample Primers Kit (Roche, США), обогащение библиотек осуществляли на наборах AVENIO Tumor Enrichment Kit (Roche, США) с использованием панели AVENIO Tumor Tissue Expanded Panel Kit (Roche, США), включающей 77 генов, ассоциированных с развитием злокачественных образований. Определение концентрации ДНК полученных библиотек выполняли на флуориметре Qubit 2.0 (Life techonologies), контроль качества — при помощи биоанализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США), секвенирование образцов — на платформе NextSeq500 (Illumina, США).
Анализ полученных данных проводили с использованием AVENIO Oncology Analysis.
Описание таргетной панели
В панель AVENIO Tumor Tissue Expanded Panel входят гены из рекомендаций NCCN, а также гены, включенные в клинические исследования:
— однонуклеотидный вариант: ABL1,AKT1, AKT2, ALK, APC, AR, ARAF, BRAF, BRCA1, BRCA2, CCND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CDKN2, CSF1R, CTNNB1, DDR2, DPYD, EGFR, ERBB2, ESR1, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR 2, FGFR 3, FLT1, FLT3, FLT4, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KEAP1, KIT, KRAS, MAP2K1, SMO, STK11, MAP2K2, MET, MLH1, MSH2, MSH6, MTOR, NF2, NFE2L2, NRAS, NTRK1, PDCD1LG2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PIK3R1, PMS2, PTCH1, PTEN, RAF1, RB1, RET, ROS1, RNF43, SMAD4, TERT, TP53, TSC1, TSC2, UGT1A1, VHL;
— инсерции, делеции: ALK, APC, BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, KIT, MET, PIK3CA, PTEN, TP53, TSC1;
— гены слияния: ALK, NTRK1, FGRF2, RET, ROS1.
Результаты исследования
Пациентки были разделены на 5 подгрупп, согласно молекулярно-биологическому подтипу: 1-я группа включала 38 (48,7%) больных с люминальным B HER2-негативным РМЖ, 2-я — 13 (16,6%) с люминальным B HER2-позитивным РМЖ, 3-я — 13 с тройным негативным РМЖ (16,6%), 4-я — 9 (11,5%) с люминальным A РМЖ, 5-я — 5 (6,6%) пациенток с нелюминальным HER2-позитивным РМЖ.
Из образцов опухолевой ткани были выделены образцы ДНК и подготовлены библиотеки для проведения секвенирования методом NGS и последующего биоинформатического анализа с целью выявления патогенных мутаций. В результате анализа выявлено 128 патогенных молекулярно-генетических нарушений в 29 генах, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований. Наиболее часто встречаемые патогенные мутации (39,7% (n=31)) выявлены в гене TP53, в 32,1% (n=25) обнаружены мутации в гене PIK3CA, в 23,5% (n=18) выявлена амплификация гена ERBB2, в 12,8% (n=10) не установлено ни одной патогенной мутации в рамках используемой таргетной онкопанели, в 10,3% (n=8) обнаружены мутации в гене AKT1, в 7,7% (n=6) — патогенные мутации в гене MET, на долю мутаций в генах PTCH1 и PTEN пришлось по 3,9% (n=3) соответственно, в 2,6% (n=2) выявлены мутации в генах BRCA2, AR, NTRK1, PMS2, в 1,3% (n=1) обнаружены мутации в генах ROS1, KIT, PDGFRA, GATA3, APC, PDCD1LG2, FLT3, MET-амплификация, EGFR-амплификация, KRAS, RB1, FLT1, MSH2, CSF1R, EGFR (табл. 2).
Таблица 2. Варианты патогенных нарушений, выявленных в образцах опухолевой ткани пациенток с РМЖ
| Ген | Количество образцов | Встречаемость, % |
| TP53 | 31 | 39,7 |
| PIK3CA | 25 | 32,1 |
| ERBB2-амплификация | 18 | 23,5 |
| Не найдено патогенных мутаций | 10 | 12,8 |
| AKT1 | 8 | 10,3 |
| MET | 6 | 7,7 |
| PTCH1 | 3 | 3,9 |
| PTEN | 3 | 3,9 |
| AR | 2 | 2,6 |
| NTRK1 | 2 | 2,6 |
| PMS2 | 2 | 2,6 |
| BRCA2 | 2 | 2,6 |
| ROS1 | 1 | 1,3 |
| KIT | 1 | 1,3 |
| PDGFRA | 1 | 1,3 |
| GATA3 | 1 | 1,3 |
| APC | 1 | 1,3 |
| PDCD1LG2 | 1 | 1,3 |
| FLT3 | 1 | 1,3 |
| MET-амплификация | 1 | 1,3 |
| EGFR-амплификация | 1 | 1,3 |
| KRAS | 1 | 1,3 |
| RB1 | 1 | 1,3 |
| FLT1 | 1 | 1,3 |
| MSH2 | 1 | 1,3 |
| CSF1R | 1 | 1,3 |
| EGFR | 1 | 1,3 |
| VHL | 1 | 1,3 |
| DPYD | 1 | 1,3 |
| TSC1 | 1 | 1,3 |
У пациенток с люминальным B HER2-отрицательным подтипом выявлены патогенные мутации в генах TP53, PIK3CA, AKT1, PTCH1, MET, NTRK1, ROS1, KIT, PDGFRA, GATA3, APC, PTEN, AR, PDCD1LG2, FLT3, EGFR. У пациенток с люминальным B HER2-положительным подтипом патогенные мутации обнаружены в генах TP53, PIK3CA, MET, FLT1, MSH2, а также амплификация в гене ERBB2, что соответствует положительному статусу HER2. В случаях тройного негативного РМЖ наиболее часто наблюдалось наличие мутаций в следующих генах: TP53, PIK3CA, AKT1, PTEN, AR, KRAS, RB1, BRCA2, EGFR-амплификация. При люминальном A-подтипе выявлены мутации в генах: TP53, PIK3CA, AKT1, MET, PMS2, CSF1R, BRCA2, а также амплификация гена MET. В образцах с нелюминальным HER2-положительным РМЖ установлены мутации в генах TP53, PIK3CA, MET, PMS2, амплификация гена ERBB2 (табл. 3).
Таблица 3. Распределение генетических нарушений по молекулярно-биологическим подтипам
| Тип мутации | Люминальный тип В HER2-отрицательный (n=38) | Люминальный тип В HER2-положительный (n=13) | Тройной негативный (n=13) | Люминальный тип А (n=9) | Нелюминальный тип HER2- положительный (n=5) |
| PIK3CA | 13 | 2 | 4 | 4 | 2 |
| TP53 | 14 | 5 | 8 | 1 | 3 |
| Не найдено патогенных мутаций | 9 | 1 | |||
| AKT1 | 4 | 3 | 1 | ||
| MET | 2 | 1 | 2 | 1 | |
| PTCH1 | 3 | ||||
| ROS1 | 1 | ||||
| KIT | 1 | ||||
| PDGFRA | 1 | ||||
| GATA3 | 1 | ||||
| APC | 1 | ||||
| PTEN | 1 | 2 | |||
| AR | 1 | 1 | |||
| PDCD1LG2 | 1 | ||||
| NTRK1 | 2 | ||||
| FLT3 | 1 | ||||
| BRCA2 | 1 | 1 | |||
| MET-амплификация | 1 | ||||
| EGFR-амплификация | 1 | ||||
| KRAS | 1 | ||||
| RB1 | 1 | ||||
| ERBB2-амплификация | 13 | 5 | |||
| FLT1 | 1 | ||||
| MSH2 | 1 | ||||
| PMS2 | 1 | 1 | |||
| CSF1R | 1 | ||||
| EGFR | 1 | ||||
| VHL | 1 | ||||
| DPYD | 1 | ||||
| TSC1 | 1 |
Обсуждение
В настоящее время в качестве стандартных молекулярно-генетических методов исследования используются ПЦР и секвенирование по Сенгеру. Однако у данных методов существует ряд ограничений. В частности, при использовании метода ПЦР определение мутаций возможно только в определенном коротком участке гена. Секвенирование по Сенгеру имеет высокую точность, но низкую производительность. Для выполнения исследований поиска мутаций в нескольких генах требуется серия постановок и занимает достаточно продолжительный интервал времени. Сокращение сроков диагностики, повышение ее качества, увеличение информативности — важные задачи в лечебном процессе. В связи с этим на первый план в лабораторной диагностике опухолевых заболеваний выходит секвенирование нового поколения (NGS), являющееся наиболее информативным методом исследования. Высокопроизводительное секвенирование позволяет более глубоко охарактеризовать опухоль каждого пациента без увеличения времени исследования и стоимости. Используя данный метод, можно получить максимально полный набор данных о структуре генетического материала опухоли, выявляя не только известные, но и никогда ранее не встречавшиеся мутации, что также имеет важное значение для разработки новых таргетных препаратов.
Расширение спектра генетического тестирования опухоли дает возможность подбора соответствующей таргетной терапии, а также позволяет определить вектор поиска молекулярных мишеней для создания новых препаратов.
На сегодняшний день известно, что опухоль имеет гетерогенную природу. Перечень выявляемых мутаций в генах, ответственных за развитие злокачественных новообразований, достаточно широк. В данном исследовании в рамках таргетной панели выявлены патогенные мутации в 28 генах, не входящих в стандартное молекулярно-генетическое тестирование, за исключением PIK3CA, BRCA. Кроме того, обнаружены различия по частоте встречаемости и типам патогенных мутаций в тех или иных генах в зависимости от молекулярно-биологического подтипа опухоли, что является фактом, представляющим интерес для углубления знаний о биологии РМЖ.
В данной работе определены наиболее часто встречаемые патогенные мутации в генах TP53, PIK3CA, AKT1, MET при РМЖ, что согласуется с данными мировой литературы [7, 8], а также молекулярно-генетические нарушения в различных генах, выявляемые в 1—4% случаев (BRCA2, PTCH1, ROS1, KIT, PDGFRA, GATA3, APC, PTEN, AR, PDCD1LG2, NTRK1, FLT3, EGFR, FLT1, MSH2, KRAS, RB1, EGFR- амплификация, PMS2, CSF1R).
В настоящее время существует большой спектр таргетных препаратов, ингибирующих молекулы-мишени, принимающих участие в канцерогенгезе, в результате появления драйверных мутаций в различных генах, а именно PIK3CA, ERBB2, KRAS и др. [9]. Помимо прочего, на разных стадиях клинических испытаний находятся таргетные препараты, воздействующие на нарушения в таких генах, как ROS1, PTEN, AR, NTRK1, RB1. Отдельно стоит отметить, что в клинических рекомендациях от 2021 г. по диагностике и лечению РМЖ пациенткам с HER2-гормонозависимым РМЖ рекомендовано исследование мутаций в гене PIK3CA для решения вопроса о назначении таргетной терапии. В настоящем исследовании было определено, что частота встречаемости патогенных мутаций в гене PIK3CA в данной группе пациенток составила 38,2%, в других подгруппах (гормононезависимых, HER2-позитивных) оказалась также достаточно высокой (33,3%). Для данных пациенток даже в случае невозможности назначения таргетной терапии информация о наличии мутаций может привести к корректировке прогноза. Именно в 2016 г. было показано, что пациентки, в опухолях которых наблюдалась мутация в 9-м экзоне гена PI3KCA, имели более благоприятный прогноз выживаемости без прогрессирования по сравнению с пациентками, в опухолях которых наблюдалась мутация в 20-м экзоне данного гена [10]. В связи с этим применение метода NGS можно рекомендовать для определения мутаций в гене PIK3CA и для других подтипов РМЖ.
Как правило, таргетная терапия направлена на молекулы-мишени для конкретных типов злокачественных образований. Однако для многих опухолей различной этиологии есть общие мишени. Так, мутации в одних и тех же генах могут приводить к развитию новообразований разной локализации и происхождения, что подводит нас к необходимости расширения показаний к назначению такой терапии.
В связи с чем можно утверждать, что результаты высокопроизводительного секвенирования могут быть использованы при выборе тактики лечения отдельных пациентов.
Заключение
Использование высокопроизводительного секвенирования в обследовании пациенток с раком молочной железы позволит усовершенствовать алгоритм молекулярной диагностики заболевания, повысить информативность результатов исследования за счет получения полной информации по исследуемым генам, сократить сроки проведения диагностики вследствие единовременного исследования сразу нескольких генов, улучшить эффективность терапии благодаря своевременному и точному выявлению генетических маркеров, критически важных для назначения таргетной терапии.
Благодарности
Данная работа была выполнена в рамках протокола поискового научного исследования «Оценка эффективности выявления молекулярных нарушений в опухолевых клетках при злокачественных новообразованиях легкого и молочной железы методом высокопроизводительного секвенирования» при поддержке ООО «АстраЗенека Фармасьютикалс», АО «Рош-Москва», ООО «Пфайзер», ООО «Новартис Фарма», ООО «Российское общество онкопатологов».
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.А. Полозников, Б.Я Алексеев
Сбор и обработка материала — М.Э. Романова, М.П. Райгородская, С.П. Прокопенко, В.Н. Гриневич, П.А. Шаталов, Н.Н. Волченко, А.П. Шинкаркина, Н.В. Кокосадзе, Е.Ю. Сенцова
Статистическая обработка — М.Э. Романова, М.П. Райгородская, А.В. Кудрявцева, М.С. Федорова, И.З. Мамедов
Написание текста — М.Э. Романова, П.А. Никифорович
Редактирование — А.А. Полозников, Б.Я Алексеев, П.В. Шегай, А.Д. Каприн
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
The authors declare no conflicts of interest