Основы анатомического понимания лимфообращения были заложены в далеком прошлом. Несколько поколений ученых-анатомов (Д. Жданов, М. Сапин, Э. Борзяк и др.) провели титанические исследования, результаты которых до сих пор являются классикой и широко используются в практической медицине, в том числе в онкологии. Более 100 лет назад была сформулирована доктрина диссеминации рака и роль лимфатической системы в этом сложном процессе. Но лимфология, подобно всем другим наукам, развивалась под влиянием новых идей. Ставя новые задачи, она применяла для их решения и новые методы, более совершенную технику.

Исторически сложилось так, что лимфатические сосуды считались пассивными участниками в процессе метастазирования, предоставляющими для опухолевых клеток только транзит к лимфатическим узлам (ЛУ). Открытие нескольких ключевых специфических лимфатических молекулярных маркеров и повышение доступности экспериментальных систем in vivo и in vitro для изучения функций лимфатических сосудов обозначили гораздо более сложную и активную их роль в метастазировании опухолей [1].

Неолимфангиогенез в норме имеет место только в процессе эмбриогенеза. В постнатальном периоде неолимфангиогенез наблюдается при определенных патологических состояниях, таких как воспаление, регенерация тканей и рост опухоли [2, 3]. Наиболее изучен процесс распространения и прорастания новых лимфатических сосудов из уже существующих [4], явление образования новых лимфатических сосудов из циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников остается малоизученным [5, 6].

Относительно недавнее определение ряда ключевых лимфатических молекулярных маркеров и факторов, способствующих росту лимфатических сосудов, расширило наше понимание физиологических и патологических процессов, характерных для лимфатических сосудов. Основным белком, который регулирует неолимфангиогенез, является VEGFR-3. VEGFR-3 активируется путем связывания с фактором роста эндотелия сосудов VEGF-C [7] или с родственным белком VEGF-D [8]. Экспрессия этих лимфангиогенных факторов, как правило, происходит при злокачественных процессах [9], что способствует созданию благоприятных условий для генерации новых лимфатических сосудов [10]. Результаты исследований клинического течения [11] и экспериментальных моделей рака молочной железы [12] указывают на увеличение плотности интратуморальных и перитуморальных лимфатических сосудов при злокачественном процессе, а также их ассоциацию с метастазами и снижением выживаемости. Агенты, нейтрализующие VEGF-C и VEGF-D или блокирующие VEGFR-3, подавляют развитие новых лимфатических сосудов, лимфатическую гиперплазию и метастазирование опухоли в экспериментальных моделях рака [13]. Важно отметить, что низкая экспрессия VEGFR-3 коррелирует с меньшим количеством метастатически пораженных ЛУ и с более высокими показателями выживаемости пациентов [14].

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что лимфатические сосуды способствуют метастазированию путем предоставления транспорта для распространения опухолевых клеток [15, 16]. В отличие от кровеносных сосудов лимфатические сосуды имеют «преимущества» для обеспечения транспорта метастатических клеток:

1) сетчатую структуру базальной мембраны и наличие «button-like» переходов;

2) более высокую (1000-кратно) концентрацию гиалуроновой кислоты, обеспечивающей мощную клеточную защиту;

3) низкую скорость тока.

Таким образом, лимфатическая система обеспечивает выживаемость транспортируемых клеток. Этим можно объяснить преимущественное лимфогенное распространение рака молочной железы [17], меланомы [18], рака предстательной железы [19], а также опухолей головы и шеи [20, 21].

При раке молочной железы чаще наблюдается инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды, нежели в кровеносные. Любая сосудистая инвазия признана в качестве неблагоприятных прогностических индикаторов [22]. Тем не менее в ранних исследованиях не проводили различия между инвазией в лимфатические сосуды (ИЛС) и инвазией в кровеносные сосуды (ИКНС) в связи с отсутствием специфических лимфатических маркеров. Открытие специфических лимфатических маркеров, таких как LYVE-1, Prox1 и podoplanin/D2−40, позволило четко разграничить ИЛС и ИКНС [23]. С помощью этих маркеров в сочетании с двойным иммуноокрашиванием получено множество доказательств возможности более легкой ИЛС по отношению к ИКНС для клеток карциномы молочной железы. Об этом свидетельствует ряд независимых исследований с участием значительного числа пациентов. Одно из крупнейших исследований, проведенных до настоящего времени (n=1408), показало наличие раковых клеток в лимфатических сосудах в 34,2% всех случаев против 4,2% в кровеносных сосудах [24]. В другом исследовании среди 177 пациентов с инвазивным раком молочной железы ИЛС обнаружена в 96,4% всех случаев, в то время ИКНС наблюдалась только в 3,5% [25].

Наличие ИЛС коррелирует с наличием метастазов в регионарные ЛУ, а также прогнозом выживаемости. В одном из исследований метастатически пораженные сторожевые лимфатические узлы (СЛУ) обнаружены у 51% пациентов с ИЛС по сравнению с 30% без ИЛС [24]. Тесная связь между ИЛС и метастазами в подмышечные ЛУ также демонстрирует другое крупное исследование (n=850), при котором метастатически пораженные ЛУ обнаружены у 51% пациентов с ИЛС по сравнению с 19% без ИЛС [26].

Некоторые исследования определили наличие ИЛС и ИКНС как плохой прогностический признак [24], но в большинстве исследований ИЛС связывают только с низкими показателями выживаемости. Это не означает, что ИКНС и гематогенное метастазирование не играют существенной роли в смертности от рака молочной железы. Очевидно, что основной причиной смерти от рака являются не метастазы в ЛУ сами по себе, а отдаленные метастазы, которые нарушают функции жизненно важных органов, таких как легкие, кости, мозг и др. Тем не менее ассоциация ИЛС с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы предполагает, что местная ИЛС в конечном итоге приводит к ИКНС, которая может возникнуть в Л.У. При раке молочной железы ИЛС встречается чаще, чем ИКНС, что свидетельствует о том, что ИЛС имеет большую прогностическую силу для исхода заболевания по сравнению с ИКНС. В совокупности эти исследования демонстрируют большую распространенность ИЛС по сравнению ИКНС при раке молочной железы. Эти данные также свидетельствуют о том, что как уже существующие, так и вновь образованные опухольассоциированные лимфатические сосуды являются основным средством регионарного метастазирования.

Принято считать, что СЛУ является первым ЛУ на пути тока лимфы от опухоли [27]. Метастазы в СЛУ обнаруживаются у 20—35% пациентов с ранними стадиями рака молочной железы. Распространение опухолевых клеток из метастатически пораженных СЛУ в дистальные ЛУ происходит у 30—35% пациентов. Наличие метастазов в СЛУ в значительной степени влияет на время безрецидивного течения и общую выживаемость пациентов. Распространенность метастатического поражения ЛУ усугубляет прогноз [28]. Таким образом, распространение опухолевых клеток при раке молочной железы преимущественно происходит лимфогенным путем.

Хотя клиническое значение регионарных метастазов при раке молочной железы хорошо известно, механизм транспортировки опухолевых клеток в ЛУ и влияние на отдаленное метастазирование являются предметом широкой дискуссии. Центральное место в этой дискуссии занимают следующие вопросы:

1. Индуцируется ли неолимфангиогенез непосредственно опухолью?

2. Каким образом происходит инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды?

3. Возможен ли транспорт опухолевых клеток через индуцированные опухолью вновь образованные лимфатические сосуды?

4. Возникают ли регионарные метастазы при отсутствии неолимфангиогенеза?

5. Влияет ли наличие метастазов в ЛУ на отдаленное метастазирование?

Ответы на эти вопросы имеют решающее значение для понимания роли постнатального индуцированного неолимфангиогенеза в общей картине метастазирования.

1. Индуцируется ли неолимфангиогенез непосредственно опухолью?

Чтобы ответить на этот вопрос, проанализированы исследования, касающиеся трех основных параметров, определяющих опухолевый неолимфангиогенез: 1) экспрессия лимфогенных факторов VEGF-C и VEGF-D; 2) наличие деления лимфатических эндотелиальных клеток, определенных пролиферативными маркерами Ki-67 или PCNA; 3) увеличение плотности лимфатических сосудов (ПЛС).

В некоторых исследованиях экспрессия VEGF-C и VEGF-D коррелировала с индукцией неолимфангиогенеза, наличием метастазов в ЛУ и выживаемостью пациентов [29]. Но имеются исследования, по результатам которых экспрессия VEGF-C обнаруживалась в большинстве исследованных опухолей, а корреляция с инвазией в лимфатические сосуды и метастазами в ЛУ не выявлена [30]. Эти расхождения могут свидетельствовать о существовании других факторов, помимо VEGF-C и VEGF-D, влияющих на индукцию неолимфангиогенеза, или могут быть связаны с неоднородностью анализируемых групп пациентов.

Обнаружение делящихся лимфатических эндотелиальных клеток (ЛЭК) приобрело центральное значение в спорах о том, происходит ли неолимфангиогенез при раке молочной железы и действительно ли лимфогенное метастазирование осуществляется через уже существующие или вновь сформированные лимфатические сосуды [31]. Эти споры существуют, потому что ни сам факт наличия пролимфогенных факторов, ни частое метастазирование в ЛУ не составляют адекватного доказательства существования опухольиндуцированного формирования новых лимфатических сосудов. Разрешение данного вопроса пытались осуществить путем двойного окрашивания, используя антитела к специфическим лимфомаркерам (LYVE-1 или D2−40) в комбинации с антителами к маркерам пролиферации, такими как Ki-67 (MIB-1) или PCNA. Этот метод имеет значительное преимущество перед ранее используемой гистологической оценкой (например, H&E) для определения делящихся ЛЭК. Однако в большинстве исследований до сих пор используется колориметрическое окрашивание, которое уступает иммунофлюоресцентному в плане различения индивидуально окрашенных структур. В результате интерпретация положительной реакции перекрывающихся лимфатических маркеров/Ki-67 может зависеть от того, рассматриваются ли позитивные клетки в качестве пролиферирующих ЛЭК или делящихся опухолевых клеток, проникших в лимфатические сосуды.

Дополнительные трудности в определении пролиферирующих ЛЭК вызывают:

1) относительно низкий уровень сосудистой формации в устоявшихся опухолях;

2) низкая плотность и гетерогенность лимфатических опухолевых сосудов в сравнении с кровеносными опухолевыми сосудами;

3) вариабельность разрастания новых сосудов в разных точках по ходу родительского лимфатического сосуда, причем последнее невозможно обнаружить при плоскостной (двухмерной) оценке. Более того, формирование новых лимфатических сосудов может происходить в отсутствие эндотелиального митотического деления, если они происходят из предшествующих или неэндотелиальных клеток путем трансдифференцировки.

При таких технических и биологических ограничениях неудивительно, что несколько исследований потерпели неудачу при обнаружении Ki-67- или PCNA-маркеров на LYVE-1 или D2−40-меченых структурах [31]. Авторы данных исследований заключили, что активный неолимфангиогенез отсутствует при раке молочной железы и лимфатическое метастазирование происходит либо через неопределенные внесосудистые маршруты, либо путем инвазии в уже существующие лимфатические сосуды, находящиеся вблизи границы опухолевой стромы. Это объяснение в целом возможно, так как ничто не может предотвратить инвазию опухолевых клеток в существующие лимфатические сосуды, если в данной опухолевой среде не сформированы новые лимфатические сосуды. Однако данные некоторых других исследований также поддерживают опухольиндуцированный неолимфангиогенез и показывают его клиническое значение при лимфогенных метастазах. Например, двойное Ki-67/podoplanin-окрашивание большого объема материала (n=177) инвазивного рака молочной железы выявило, что 29% образцов отображали Ki-67-позитивное ядро в 2,2% интратуморальных, перитуморальных и периферических лимфатических образованиях [25]. Частота выявления была тесно связана с высокой лимфатической плотностью (p=0,001), метастазами в лимфатические узлы и выживаемостью [25]. Независимые исследования выявили схожую фракцию пролиферирующих ЛЭК (ЛЭКП) в перитуморальных лимфатических образованиях, а также идентифицировали ЛЭКП как независимый прогностический фактор метастазирования в Л.У. Исследования, которые сравнивали ЛЭКП при воспалительном и невоспалительном раке молочной железы, выявили, что последний имеет как высокий уровень Ki-67 в лимфатических образованиях (80% против 50%), так и повышенную медиану ЛЭКП [15]. Активный неолимфангиогенез также обнаружен в позитивных СЛУ [32], которые показали значимо большую медиану ЛЭКП (p<0,001), чем не пораженные метастазами Л.У. Более того, высокая частота Ki-67-меченых лимфатических образований в позитивных СЛУ тесно связана (p=0,01) с метастазами в подмышечную область, подтверждая, что опухольиндуцированный неолимфангиогенез вызывает диссеминацию как из первичной опухоли, так и из вторичных метастатических очагов. Несмотря на это, исключая очень высокую активность неолимфангиогенеза при воспалительном раке молочной железы [13], относительно низкая фракция ЛЭКП (2—6%) и некоторое несоответствие между высоким процентом ПЛС и низким ЛЭКП при других типах рака молочной железы дают возможность полагать, что в лимфогенном метастазировании принимают участие как новые, так и существующие лимфатические сосуды.

Изначально количественное определение ПЛС при неолимфангиогенезе казалось простой задачей. Ожидалось, что количественный анализ интра-, перитуморальных и неопухолевых лимфатический сосудов должен решить вопрос о индукции неолимфангиогенеза, аналогично определению плотности кровеносных сосудов в качестве надежного индикатора опухольиндуцированного ангиогенеза [33]. Однако технически количественное определение ПЛС оказалось более сложной задачей, чем определение плотности кровеносных сосудов из-за естественной неоднородности распределения лимфатических сосудов. Дополнительная сложность связана с тем, что в отличие от кровеносных сосудов лимфатические сосуды способствуют распространению метастатических клеток, но не пролиферации опухолевых клеток и увеличению массы опухоли. Вследствие этого при иммуногистохимическом анализе микроанатомические увеличения ПЛС могут быть пропущены, хотя их наличие может быть достаточным для распространения опухоли у пациента. В результате находки и интерпретации исследований в отношении редко встречающихся интратуморальных лимфатических сосудов или в сравнении с гетерогенными ПЛС-структурами к более упорядоченному распределению опухолевых кровеносных сосудов подпитывают споры о том, происходит ли неолимфангиогенез при раке молочной железы.

Основными доказательствами, подтверждающими предположение, что неолимфангиогенез не индуцируется опухолью, является обнаружение снижения интратуморальной ПЛС или отсутствие интратуморальных лимфатических сосудов по сравнению с нормальной тканью молочной железы [13, 31]. Те же исследования, однако, свидетельствуют о значительном увеличении (p=0,0001) перитуморальной ПЛС [31, 34], где некоторые лимфатические сосуды содержали опухолевые эмболы [35]. Аналогичные результаты также получены в независимом исследовании (n=180), в котором интратуморальные лимфатические сосуды обнаружены только в 12% образцов, в то время как перитуморальные — в 94% [36]. Перевес в сторону развития перитуморальных лимфатических сосудов также отмечен в исследовании 177 случаев инвазивного рака молочной железы, в которых внутри- и перитуморальные лимфатические сосуды обнаружены в 41 и 100% случаев соответственно [25]. Существует широкий спектр мнений в отношении прогностического значения интратуморальной ПЛС. Консенсус достигнут только в том, что увеличение перитуморальной ПЛС может быть достаточным фактором для транзита опухолевых клеток в ЛУ даже при отсутствии интратуморальных лимфатических сосудов.

Таким образом, точка в вопросе определения главного индуктора неолимфангиогенеза не поставлена.

2. Каким образом происходит инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды?

Было высказано предположение, что опухолевые клетки в дополнение к пассивной миграции в лимфатические сосуды могут использовать физиологические аттрактанты SDF-1 (также известный, как CXCL12) и CCL21. Эта гипотеза подтверждается несколькими линиями доказательств. Во-первых, в значительном количестве случаев рака молочной железы (30—70%) наблюдалась экспрессия CXCR4 и/или CCR7, которые являются рецепторами для SDF-1 и CCL21 соответственно. Экспрессия CXCR4 и CCR7 сильно коррелирует с наличием метастазов в ЛУ [37]. Во-вторых, SDF-1 экспрессируется на высоком уровне в тканях, которые часто являются мишенями для метастазов при раке молочной железы, в том числе ЛУ, легких, печени, костном мозге, стимулируют миграцию клеток карциномы молочной железы [38]. В-третьих, стимулирование либо CXCR4, либо CCR7 с соответствующими лигандами увеличивает миграцию и инвазию культивируемых клеток рака молочной железы [39]. В-четвертых, на экспериментальной модели рака молочной железы показано, что антагонисты или нейтрализаторы этих рецепторов значительно сокращают количество регионарных и отдаленных метастазов [39]. В совокупности эти исследования свидетельствуют о том, что CXCR4- или CCR7-положительные опухоли молочной железы могут проявлять повышенный потенциал метастазирования.

Таким образом, раковые клетки, помимо пассивного транспорта, используют дополнительные физиологические рычаги, способствующие их инвазии в лимфатическое русло.

3. Возможен ли транспорт опухолевых клеток через индуцированные опухолью вновь образованные лимфатические сосуды?

В ряде экспериментов показано, что при афункциональности интратуморальных лимфатических сосудов возможны функциональная состоятельность перитуморальных лимфатических сосудов [40], а также наличие лимфогенных метастазов без интратуморальной лимфатической васкуляризации [41]. Это также подтверждается экспериментальными исследованиями меланомы B16-F10, экспрессирующей VEGF-C, которые продемонстрировали в 40% функциональность перитуморальных, но не интратуморальных лимфатических сосудов [42]. В отдельном исследовании с использованием флюоресцентного красителя, который вводился проксимальнее имплантированной в ногу мышей меланомы B16-F10, выявлено 23-кратное увеличение лимфооттока до подколенного ЛУ по сравнению с лимфооттоком у мышей, которым опухоль не имплантировалась [43]. Исследование опухолей молочной железы MDA-MB-231 с использованием флюоресцентных методов показало, что опухоль способна расширять лимфатическую сеть, а также осуществлять через нее транспорт метастатических клеток [44].

Изначально считалось, что основными факторами лимфогенного метастазирования являются доступ опухолевых клеток к лимфатическим сосудам и скорость тока жидкости в них. Однако другие важные факторы — индукция опухолью неолимфангиогенеза и увеличение тока лимфы вокруг Л.У. Этот процесс, называемый лимфатической васкуляризацией ЛУ (ЛВЛУ), обнаружен в нескольких моделях опухолей и воспаления на животных, а также подтвержден клиническими наблюдениями.

ЛВЛУ обнаружена при исследовании модели меланомы B16-F10, где опухоль имплантировалась в конечность мышей линии C57BL/J6. Наблюдалось 9-кратное (р<0,0001) увеличение тока лимфы через опухольдренирующий подколенный ЛУ по сравнению с ЛУ, не дренирующим опухоль. Примечательно, что ЛВЛУ наблюдалась до обнаружения в этом ЛУ метастатических поражений [42]. Аналогичные результаты получены и в других исследованиях. Эти исследования показали, что дренаж лимфатических сосудов при опухолях увеличивается, а не уменьшается, как это было предложено ранее [46]. Таким образом, анализ исследований, касающихся транспорта опухолевых клеток через лимфатические сосуды, образованные при неолимфангиогенезе, свидетельствует о возможности транспорта раковых клеток через вновь образованные сосуды.

4. Возникают ли регионарные метастазы при отсутствии неолимфангиогенеза?

Лимфогенное метастазирование зависит не только от индуцированных лимфатических сосудов, хотя, несомненно, увеличение количества лимфатических сосудов значительно увеличивает потенциал ИЛС. ИЛС затрагивает как уже существующие, так и новые сосуды, но в некоторых случаях при раке молочной железы ИЛС происходит без образования новых сосудов только за счет уже существующих сосудов [35].

5. Влияет ли наличие метастазов в ЛУ на отдаленное метастазирование?

Наиболее важно решить, прекращают ли метастатические клетки свою миграцию, достигнув ЛУ, или продолжают распространяться по всему телу. Метастазы в ЛУ сами по себе не опасны для жизни и могут быть удалены хирургическим путем, только отдаленные метастазы в кости и внутренние органы приводят к смерти пациентов при раке молочной железы и других солидных опухолях [7].

Существуют два противоположных мнения по этому вопросу. Одна школа считает, что метастазы в ЛУ просто отражают агрессивность опухоли, не оказывая влияния на метастазирование в отдаленные органы. Это предположение базируется в основном на данных клинических испытаний, демонстрирующих отсутствие различий в выживаемости пациентов, перенесших лимфаденэктомию [47]. Второй аргумент в пользу этой гипотезы основан на концепции, что метастатические клетки органоспецифичны и адаптированы к лимфатической циркуляции, а клетки, поражающие лимфатическую систему, не могут развиваться в других местах. Противники этой точки зрения утверждают, что хотя первичные опухоли могут распространяться независимо от метастазов в ЛУ, последние в значительной степени способствуют метастазированию, выступая в роли колоний, продуцирующих новые метастатические клетки.

Однако вопрос пользы лимфаденэктомии при лечении рака молочной железы остается спорным. Во-первых, отсутствие терапевтического значения лимфаденэктомии в основном базируется на исследованиях, проведенных в 1980—2000 гг. [46], когда рак молочной железы диагностировался на более поздних стадиях заболевания. Во-вторых, в более ранних исследованиях наличие метастазов в ЛУ в первую очередь определялось гистологическим методом, который неинформативен при выявлении в 20—50% случаев микрометастазирования в отличие от иммуноокрашивания антицитокератином [48]. Действительно, пересмотр препаратов ЛУ с использованием окрашивания антицитокератином выявил микрометастазы в 20% случаев, что продемонстрировало различия в безрецидивной и общей выживаемости в группах с проведенной лимфаденэктомией и без нее. В-третьих, недавние клинические испытания показали значительное преимущество проведения у пациентов с меланомой одномоментной лимфаденэктомии даже при небольших опухолях, что ставит под сомнение ранее сделанные выводы. В-четвертых, экспериментальная модель меланомы также показала значительное увеличение выживаемости мышей с небольшими опухолями, у которых произвели одномоментную лимфаденэктомию СЛУ [48]. То же исследование показало, что опухолевые клетки как первичной опухоли, так и СЛУ имеют равный метастатический потенциал колонизации отдаленных органов [48]. Наконец, большая часть исследований о биологии опухоли прямо противоречит мнению, что ЛУ являются последней инстанцией для метастатических клеток [49].

В аспектах изучения лимфатической системы, ее трансформации при злокачественных новообразованиях и роли в качестве компонента метастатического каскада остается масса нерешенных вопросов. Многосторонние многочисленные исследования позволили значительно продвинуться в определении ее места в канцерогенезе в целом не только с точки зрения практического значения, но и с точки зрения фундаментальных исследований.

При этом во всем мире основная масса исследований последних лет направлена на поиск регуляторов метастазирования на молекулярном уровне, что очевидно с точки зрения последующей разработки методов лечения путем воздействия на эти регуляторы. Морфологической перестройке лимфатического русла уделяется значительно меньшее внимание. Во многом это связано с большой вариабельностью расположения сосудов, образованных в результате развития опухолевого процесса, относительно друг друга, а также наличием окружающих мягких тканей. Но знания о механизмах лимфогенного метастазирования не могут рассматриваться в отрыве от гидродинамических процессов в лимфатическом русле. Образование новых сосудов, перераспределение тока лимфы оказывают влияние и на логистику метастатических клеток. Противостояние метастазированию является одним из ключевых моментов в лечении онкологических больных. Дальнейшее понимание роли постнатального индуцированного неолимфангиогенеза в метастазировании опухолей важно как для прогноза онкологического заболевания, так и для разработки новых лекарственных препаратов, обладающих антиметастатической активностью.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.