Рак легкого является преобладающей формой среди злокачественных новообразований, до 80% приходится на немелкоклеточный рак. Отдаленные результаты лечения и выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) далеки от желаемых. В связи с этим актуальным является изучение морфологических критериев, связанных с важнейшими клинико-морфологическими параметрами опухоли, способными с большой долей вероятности прогнозировать течение заболевания, и выживаемостью больных НМРЛ [1].

В настоящее время исследование аргирофильных белков, ассоциированных с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белков), является общепризнанным маркером пролиферативной активности и скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка — С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5—3 раза в S- и G2-фазы [2]. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла [3], временем удвоения клеток опухоли [4, 5].

В патогистологической практике с целью объективизации и стандартизации исследования Ag-ЯОР-белков предложено использовать компьютерные программы анализа изображения и внутренний контроль окрашивания [6—9]. В связи с наличием гетерогенности клеточных популяций в пределах одной опухоли наряду с определением количественных показателей Ag-ЯОР-белков предлагается оценивать показатель вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли — коэффициент вариации (КВ) [10].

Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи Ag-ЯОР-белков с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных со злокачественными опухолями [11—15]. Отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь количественных показателей и гетерогенности Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при НМРЛ.

Цель настоящей работы — исследование количественного содержания и гетерогенности Ag-ЯОР-белков во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных при НМРЛ.

Исследованы 243 операционных материала НМРЛ за период 2007—2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно критериям ВОЗ [16]. Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет). Мужчин было 209, женщины — 34. В качестве контроля исследованы кусочки патологически неизмененной ткани легкого из удаленных от опухоли участков в 10 случаях.

Кусочки ткани фиксировали 18—24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили гистохимическое окрашивание ШИК-реактивом/альциановым синим по Крейбергу для первичной дифференциальной диагностики с целью обнаружения слизи в опухолевых клетках, что было особенно актуально для низкодифференцированных опухолей. Кроме того, для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью иммуногистохимическим методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12) в автоматическом стейнере Ventana XT (контроль окрашивания — эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Для карцином железистого генеза характерным было положительное окрашивание на цитокератины 7/20 и отрицательное на цитокератины High Molecular Weight, и, наоборот, для карцином плоскоклеточного генеза — положительное окрашивание на цитокератины High Molecular Weight и отрицательное на цитокератины 7/20.

Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [17]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120 °C 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0) [6, 7]. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в канадский бальзам. В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм²) в ядрах 100—120 случайно выбранных клеток с 10—15 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении в 1000 (объектив ×100, 1,25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм² исключены из анализа. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [8]. Находили индекс площади Ag-ЯОР-белков — частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците; в каждом случае вычисляли среднее значение и КВ (в %) Ag-ЯОР-белков.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Так как полученные данные в выборках соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро—Уилка W=0,99, р>0,05), то меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), а меру рассеяния в виде стандартного отклонения (SD). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: U-тест Манна—Уитни (M—W), коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Определяли общую скорректированную выживаемость больных за 5-летний период после операции (в %), использовали метод Каплана—Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р<0,05.

Результат окраски срезов азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра. В ядрах малых лимфоцитов чаще определялась одна гранула серебра, реже две. Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 (0,12) мкм², КВ Ag-ЯОР-белков — 19,7 (1,1)%.

Результаты определения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМРЛ во взаимосвязи с морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в табл. 1.

В клетках НМРЛ ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,52 (1,66), КВ Ag-ЯОР-белков — 30,5 (4,6)%. В ядрах клеток патологически неизмененного эпителия альвеол ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,31 (0,20), КВ Ag-ЯОР-белков 28,3 (3,1)%; в эпителии бронхов ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,85 (0,24), КВ Ag-ЯОР-белков 29,3 (3,3)%. В клетках немелкоклеточного рака легкого наблюдалось статистически значимое повышение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с патологически неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001 и р<0,01). Увеличение площади и вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с патологически неизмененной тканью подтверждало факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза.

ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше в группе Т2—3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли более 3 см ИП и КВ Ag-ЯОР-белков были больше, чем в опухоли менее 3 см. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,34, р<0,001 и r=0,29, р=0,006 соответственно) и размером первичной опухоли (r=0,45, р<0,001 и r=0,34, р<0,001 соответственно). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение количественных показателей ядрышковых организаторов и их гетерогенности в клетках опухоли, что указывало на повышение пролиферативной активности в процессе роста опухоли и ее неоднородности в больших по размеру опухолях.

Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рис. 1, а, б).

Показатель N при НМРЛ имел умеренную корреляцию только с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, метастатический потенциал НМРЛ был связан с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов опухолевых клеток.

ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше при II и III стадиях, чем при I. Стадия процесса при НМРЛ имела умеренную корреляцию только с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, на ранних этапах опухолевого роста количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны по сравнению с последующими стадиями процесса.

ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше в плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой. Гистогенез НМРЛ имел умеренную корреляцию с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001 и r=0,29, р=0,01 соответственно). Таким образом, отмечена зависимость количественных показателей и гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли.

В клетках НМРЛ ИП и КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой. Степень дифференцировки НМРЛ имела умеренную корреляцию с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р<0,001 и r=0,27, р=0,02 соответственно).

Количественные показатели и гетерогенность ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМРЛ. Так как среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,52 и более считались с высоким ИП Ag-ЯОР-белков (+ИП), до 6,52 — с низким (–ИП). Аналогично, для КВ Ag-ЯОР-белков среднее значение составило 30,5%, поэтому случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 30,5% и более считались с высоким КВ Ag-ЯОР-белков (+КВ), до 30,5 — с низким (–КВ). Выделены четыре типа НМРЛ в зависимости от взаимного содержания ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (табл. 2). С выделенными типами опухолей наблюдалась незначительная корреляция основных морфологических параметров НМРЛ: показателя T (r=0,27, р=0,01), размера опухоли до 3 см и более (r=0,33, р<0,001), показателя N (r=0,27, р=0,01), стадии процесса (r=0,33, р<0,001), гистогенеза (r=0,25, р=0,02) и степени дифференцировки опухоли (r=0,28, р=0,007).

Общая скорректированная выживаемость больных НМРЛ за 5-летний период после операции составила 40,3±3,7%. Выживаемость больных НМРЛ имела статистически значимое различие в зависимости от ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (табл. 2, рис. 2, а, б).

Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: 1-й тип — 2-й и 3-й типы — 4-й тип. Статистически значимые различия выживаемости больных получены только между 1-м и 4-м, 1-м и 3-м, 4-м и 2-м типами (см. табл. 2, рис. 2, в). Исходя из полученных данных 2-й и 3-й типы НМРЛ объединены в «промежуточный» тип, в котором ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли имели противоположные значения (–ИП/+КВ и +ИП/–КВ). Выживаемость больных с «промежуточным» типом опухоли статистически значимо различалась от аналогичного показателя при опухолях 1-го и 4-го типов и имела промежуточное значение (см. табл. 2, рис. 2, г).

При проведении многомерного регрессионного анализа показатель Т, степень дифференцировки, ИП Ag-ЯОР-белков, данные о выделении четырех или трех типов опухоли (по содержанию ИП и КВ Ag-ЯОР-белков) не имели влияния на выживаемость больных НМРЛ. Большее влияние на выживаемость имели размер опухоли и показатель N, чем стадия процесса (χ²=103,9 и χ²=91,5 соответственно).

Исследовано влияние на выживаемость размера опухоли, гистогенеза и КВ Ag-ЯОР-белков в опухолях с отсутствием и наличием метастазов в лимфатических узлах. При НМРЛ с отсутствием метастазов выживаемость больных была связана с размером и гистогенезом опухоли (χ²=23,1; р<0,001), при наличии метастазов — с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли (χ²=28,3; р<0,001) (табл. 3).

Таким образом, показатель N (отсутствие или наличие метастазов), размер опухоли (до 3 см и более), гистогенез (аденокарцинома или плоскоклеточный рак), КВ Ag-ЯОР-белков (низкий или высокий) имели независимое влияние на выживаемость больных НМРЛ. При этом показатель N имел наибольшее значение (см. табл. 3).

В НМРЛ ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели умеренную положительную корреляцию (r=0,43, р<0,001), что указывает на связь изменений количественных показателей ядрышковых организаторов и их гетерогенности в клетках опухоли. В исследовании необходимо учитывать факт наличия гетерогенности ядрышковых организаторов: с увеличением размера, в плоскоклеточном раке, снижении степени дифференцировки, а в случаях с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов в опухолевых клетках необходимо увеличить количество исследуемых кусочков из разных мест опухоли.

Увеличение количественных показателей и гетерогенности ядрышковых организаторов при НМРЛ по сравнению с патологически неизмененным эпителием бронхов и альвеол имеет дифференциально-диагностическое значение при исследовании патогистологического материала из легкого. Аналогичные результаты получены нами при исследовании эпителиальных опухолей толстой кишки, желудка, гладкомышечных опухолей матки [9, 18, 19].

ИП Ag-ЯОР-белков в клетках НМРЛ был связан с рядом клинико-морфологических параметров по системе TNM: показателями Т, N, размером первичной опухоли, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. В ряде исследований получены аналогичные выводы при исследовании ядрышковых организаторов при раке легкого [13—15]. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного, объективного дифференциально-диагностического критерия при НМРЛ.

КВ Ag-ЯОР-белков в клетках НМРЛ был связан с показателем Т, размером первичной опухоли, гистогенезом и дифференцировкой опухоли, что отражает нарастание гетерогенности клеточных популяций внутри опухоли в отношении синтеза рРНК и, вероятно, скорости прохождения фаз клеточного цикла клетками. В доступной литературе единичные исследования посвящены изучению КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток опухоли [20—22]. В этих исследованиях на материале железистого рака молочной железы и плоскоклеточного рака полости рта также показана взаимосвязь гетерогенности (КВ Ag-ЯОР-белков) ядрышковых организаторов с важнейшими клинико-морфологическими параметрами по системе TNM. Кроме того, с целью стандартизации и воспроизводимости результатов исследования ядрышковых организаторов необходимо использовать компьютерный анализ изображений совместно с внутренним контролем окрашивания (ИП Ag-ЯОР-белков) и показателем гетерогенности (КВ Ag-ЯОР-белков).

Выживаемость больных НМРЛ с –ИП или –КВ достоверно выше по сравнению с опухолями с +ИП или +КВ. Такая взаимосвязь количественного содержания и гетерогенности ядрышковых организаторов с выживаемостью больных со злокачественными опухолями прослежена и в других исследованиях [11—15, 20—22]. По данным литературы, взаимосвязь активности ядрышковых организаторов с выживаемостью больных карциномой разных органов и гистогенеза значительно чаще прослеживается при определении площади Ag-ЯОР-белков с помощью компьютерного анализа изображений, чем при визуальном подсчете количества Ag-ЯОР-белков.

В зависимости от взаимного содержания ИП и КВ Ag-ЯОР-белков выделены четыре типа НМРЛ: –ИП/–КВ, –ИП/+КВ, +ИП/–КВ, +ИП/+КВ. В нашем исследовании не получено статистически значимого различия в выживаемости больных с типами опухоли –ИП/+КВ и +ИП/–КВ. Поэтому эти два типа были объединены в один, при котором выживаемость достоверно различалась от –ИП/–КВ и +ИП/+КВ типов и имела промежуточное значение. Этот факт указывает на влияние гетерогенности ядрышковых организаторов на выживаемость больных и уточняет прогностическую значимость данного исследования.

При проведении многомерного регрессионного анализа показатель N, размер опухоли, гистогенез, КВ Ag-ЯОР-белков имели независимое влияние на выживаемость больных НМРЛ. Многочисленные исследования, посвященные изучению активности ядрышковых организаторов в злокачественных опухолях, также указывают, что содержание Ag-ЯОР-белков является независимым фактором прогноза [11—15, 20—22]. При НМРЛ с отсутствием метастазов в лимфатических узлах выживаемость больных была связана с размером и гистогенезом опухоли, а при наличии метастазов   с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли. Вероятно, выживаемость больных НМРЛ без метастатического потенциала в большей степени связана со скоростью роста первичной опухоли (локальным увеличением размера), а с появлением метастатического потенциала — с гетерогенностью биосинтетической функции популяции раковых клеток.

Таким образом, исследование количественных показателей и гетерогенности ядрышковых организаторов имеет дифференциально-диагностическое и прогностическое значение при НМРЛ.

1. ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ связан с важнейшими клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателями Т, N, размером первичной опухоли до 3 см и более, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. КВ Ag-ЯОР-белков взаимосвязан с показателем Т, размером первичной опухоли до 3 см и более, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного, объективного дифференциально-диагностического критерия при разграничении клинико-морфологических параметров по системе TNM в НМРЛ.

2. Выживаемость больных НМРЛ лучше при опухолях с низким ИП или КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с опухолями с высоким ИП или КВ Ag-ЯОР-белков.

3. Выживаемость больных НМРЛ высокая при опухолях с низким ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (тип –ИП/–KВ), низ-кая — с высоким ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (тип +ИП/+KВ), промежуточная — с противоположными значениями ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (типы –ИП/+KВ и +ИП/–KВ).

4. Показатель N, размер опухоли, гистогенез, КВ Ag-ЯОР-белков — независимые факторы прогноза при НМРЛ. При НМРЛ с отсутствием метастазов в лимфатических узлах выживаемость больных связана с размером опухоли и гистогенезом, а при наличии метастазов — с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли.

Участие авторов:

Сбор и обработка материала: А.М.А., И.П.Б., Н.М.К., Е.Ю.Б., С.А.Л., А.Ф.Л.

Статистическая обработка: Д.С.К.

Написание текста: Д.С.К.

Редактирование: Е.Л.Л., Л.М.Н.

Конфликт интересов отсутствует.