Кобяков Д.С.

МБЛПУ «Когалымская городская больница», 628481 Когалым

Бычкова Е.Ю.

лаборатория молекулярной диагностики Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 656049 Барнаул

Авдалян А.М.

Алтайский филиал ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН, Барнаул

Бобров И.П.

Алтайский филиал ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН

Лазарев А.Ф.

Алтайский филиал ФГБНУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Барнаул, Россия;
КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», Барнаул, Россия

Лазарев С.А.

лаборатория молекулярной диагностики Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 656049 Барнаул

Круглова Н.М.

Алтайский филиал ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН, Барнаул

Лушникова Е.Л.

ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, 630117 Новосибирск

Непомнящих Л.М.

ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, 630117 Новосибирск

Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных при немелкоклеточном раке легкого

Авторы:

Кобяков Д.С., Бычкова Е.Ю., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Лазарев С.А., Круглова Н.М., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М.

Подробнее об авторах

Прочитано: 936 раз


Как цитировать:

Кобяков Д.С., Бычкова Е.Ю., Авдалян А.М., и др. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных при немелкоклеточном раке легкого. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2014;3(4):19‑24.
Kobyakov DS, Bychkova EYu, Avdalian AM, et al. Relationship of argyrophilic nucleolar organizer region-associated proteins to clinical and morphological parameters and survival in patients with non-small cell lung cancer. P.A. Herzen Journal of Oncology. 2014;3(4):19‑24. (In Russ.)

Рекомендуем статьи по данной теме:

Рак легкого является преобладающей формой среди злокачественных новообразований, до 80% приходится на немелкоклеточный рак. Отдаленные результаты лечения и выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) далеки от желаемых. В связи с этим актуальным является изучение морфологических критериев, связанных с важнейшими клинико-морфологическими параметрами опухоли, способными с большой долей вероятности прогнозировать течение заболевания, и выживаемостью больных НМРЛ [1].

В настоящее время исследование аргирофильных белков, ассоциированных с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белков), является общепризнанным маркером пролиферативной активности и скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка — С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5—3 раза в S- и G2-фазы [2]. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла [3], временем удвоения клеток опухоли [4, 5].

В патогистологической практике с целью объективизации и стандартизации исследования Ag-ЯОР-белков предложено использовать компьютерные программы анализа изображения и внутренний контроль окрашивания [6—9]. В связи с наличием гетерогенности клеточных популяций в пределах одной опухоли наряду с определением количественных показателей Ag-ЯОР-белков предлагается оценивать показатель вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли — коэффициент вариации (КВ) [10].

Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи Ag-ЯОР-белков с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных со злокачественными опухолями [11—15]. Отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь количественных показателей и гетерогенности Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при НМРЛ.

Цель настоящей работы — исследование количественного содержания и гетерогенности Ag-ЯОР-белков во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных при НМРЛ.

Материал и методы

Исследованы 243 операционных материала НМРЛ за период 2007—2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно критериям ВОЗ [16]. Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет). Мужчин было 209, женщины — 34. В качестве контроля исследованы кусочки патологически неизмененной ткани легкого из удаленных от опухоли участков в 10 случаях.

Кусочки ткани фиксировали 18—24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили гистохимическое окрашивание ШИК-реактивом/альциановым синим по Крейбергу для первичной дифференциальной диагностики с целью обнаружения слизи в опухолевых клетках, что было особенно актуально для низкодифференцированных опухолей. Кроме того, для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью иммуногистохимическим методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12) в автоматическом стейнере Ventana XT (контроль окрашивания — эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Для карцином железистого генеза характерным было положительное окрашивание на цитокератины 7/20 и отрицательное на цитокератины High Molecular Weight, и, наоборот, для карцином плоскоклеточного генеза — положительное окрашивание на цитокератины High Molecular Weight и отрицательное на цитокератины 7/20.

Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [17]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120 °C 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0) [6, 7]. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в канадский бальзам. В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100—120 случайно выбранных клеток с 10—15 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении в 1000 (объектив ×100, 1,25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм2 исключены из анализа. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [8]. Находили индекс площади Ag-ЯОР-белков — частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците; в каждом случае вычисляли среднее значение и КВ (в %) Ag-ЯОР-белков.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Так как полученные данные в выборках соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро—Уилка W=0,99, р>0,05), то меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), а меру рассеяния в виде стандартного отклонения (SD). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: U-тест Манна—Уитни (M—W), коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Определяли общую скорректированную выживаемость больных за 5-летний период после операции (в %), использовали метод Каплана—Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результат окраски срезов азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра. В ядрах малых лимфоцитов чаще определялась одна гранула серебра, реже две. Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 (0,12) мкм2, КВ Ag-ЯОР-белков — 19,7 (1,1)%.

Результаты определения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМРЛ во взаимосвязи с морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в табл. 1.

Таблица 1. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в немелкоклеточном раке легкого

В клетках НМРЛ ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,52 (1,66), КВ Ag-ЯОР-белков — 30,5 (4,6)%. В ядрах клеток патологически неизмененного эпителия альвеол ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,31 (0,20), КВ Ag-ЯОР-белков 28,3 (3,1)%; в эпителии бронхов ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,85 (0,24), КВ Ag-ЯОР-белков 29,3 (3,3)%. В клетках немелкоклеточного рака легкого наблюдалось статистически значимое повышение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с патологически неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001 и р<0,01). Увеличение площади и вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с патологически неизмененной тканью подтверждало факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза.

ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше в группе Т2—3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли более 3 см ИП и КВ Ag-ЯОР-белков были больше, чем в опухоли менее 3 см. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,34, р<0,001 и r=0,29, р=0,006 соответственно) и размером первичной опухоли (r=0,45, р<0,001 и r=0,34, р<0,001 соответственно). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение количественных показателей ядрышковых организаторов и их гетерогенности в клетках опухоли, что указывало на повышение пролиферативной активности в процессе роста опухоли и ее неоднородности в больших по размеру опухолях.

Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рис. 1, а, б).

Рис. 1. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки), в ядрах клеток умереннодифференцированного плоскоклеточного рака легкого с отсутствием (а) и наличием (б) метастазов в региональных лимфатических узлах. Окраска азотнокислым серебром. ×1000.

Показатель N при НМРЛ имел умеренную корреляцию только с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, метастатический потенциал НМРЛ был связан с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов опухолевых клеток.

ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше при II и III стадиях, чем при I. Стадия процесса при НМРЛ имела умеренную корреляцию только с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, на ранних этапах опухолевого роста количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны по сравнению с последующими стадиями процесса.

ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в НМРЛ достоверно больше в плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой. Гистогенез НМРЛ имел умеренную корреляцию с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001 и r=0,29, р=0,01 соответственно). Таким образом, отмечена зависимость количественных показателей и гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли.

В клетках НМРЛ ИП и КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой. Степень дифференцировки НМРЛ имела умеренную корреляцию с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р<0,001 и r=0,27, р=0,02 соответственно).

Количественные показатели и гетерогенность ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМРЛ. Так как среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,52 и более считались с высоким ИП Ag-ЯОР-белков (+ИП), до 6,52 — с низким (–ИП). Аналогично, для КВ Ag-ЯОР-белков среднее значение составило 30,5%, поэтому случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 30,5% и более считались с высоким КВ Ag-ЯОР-белков (+КВ), до 30,5 — с низким (–КВ). Выделены четыре типа НМРЛ в зависимости от взаимного содержания ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (табл. 2). С выделенными типами опухолей наблюдалась незначительная корреляция основных морфологических параметров НМРЛ: показателя T (r=0,27, р=0,01), размера опухоли до 3 см и более (r=0,33, р<0,001), показателя N (r=0,27, р=0,01), стадии процесса (r=0,33, р<0,001), гистогенеза (r=0,25, р=0,02) и степени дифференцировки опухоли (r=0,28, р=0,007).

Таблица 2. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков и 5-летняя общая скорректированная выживаемость при НМРЛ

Общая скорректированная выживаемость больных НМРЛ за 5-летний период после операции составила 40,3±3,7%. Выживаемость больных НМРЛ имела статистически значимое различие в зависимости от ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (табл. 2, рис. 2, а, б).

Рис. 2. Выживаемость по Каплану—Мейеру больных НМРЛ с низким и высоким ИП Ag-ЯОР-белков (а); с низким и высоким КВ Ag-ЯОР-белков (б); четырех (в) и трех (г) типов опухоли (по взаимному содержанию ИП и КВ Ag-ЯОР-белков). По оси абсцисс — время жизни (дни), по оси ординат — доля выживших больных.

Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: 1-й тип — 2-й и 3-й типы — 4-й тип. Статистически значимые различия выживаемости больных получены только между 1-м и 4-м, 1-м и 3-м, 4-м и 2-м типами (см. табл. 2, рис. 2, в). Исходя из полученных данных 2-й и 3-й типы НМРЛ объединены в «промежуточный» тип, в котором ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли имели противоположные значения (–ИП/+КВ и +ИП/–КВ). Выживаемость больных с «промежуточным» типом опухоли статистически значимо различалась от аналогичного показателя при опухолях 1-го и 4-го типов и имела промежуточное значение (см. табл. 2, рис. 2, г).

При проведении многомерного регрессионного анализа показатель Т, степень дифференцировки, ИП Ag-ЯОР-белков, данные о выделении четырех или трех типов опухоли (по содержанию ИП и КВ Ag-ЯОР-белков) не имели влияния на выживаемость больных НМРЛ. Большее влияние на выживаемость имели размер опухоли и показатель N, чем стадия процесса (χ2=103,9 и χ2=91,5 соответственно).

Исследовано влияние на выживаемость размера опухоли, гистогенеза и КВ Ag-ЯОР-белков в опухолях с отсутствием и наличием метастазов в лимфатических узлах. При НМРЛ с отсутствием метастазов выживаемость больных была связана с размером и гистогенезом опухоли (χ2=23,1; р<0,001), при наличии метастазов — с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли (χ2=28,3; р<0,001) (табл. 3).

Таблица 3. Регрессионный анализ по Коксу и факторы прогноза при НМРЛ

Таким образом, показатель N (отсутствие или наличие метастазов), размер опухоли (до 3 см и более), гистогенез (аденокарцинома или плоскоклеточный рак), КВ Ag-ЯОР-белков (низкий или высокий) имели независимое влияние на выживаемость больных НМРЛ. При этом показатель N имел наибольшее значение (см. табл. 3).

В НМРЛ ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели умеренную положительную корреляцию (r=0,43, р<0,001), что указывает на связь изменений количественных показателей ядрышковых организаторов и их гетерогенности в клетках опухоли. В исследовании необходимо учитывать факт наличия гетерогенности ядрышковых организаторов: с увеличением размера, в плоскоклеточном раке, снижении степени дифференцировки, а в случаях с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов в опухолевых клетках необходимо увеличить количество исследуемых кусочков из разных мест опухоли.

Увеличение количественных показателей и гетерогенности ядрышковых организаторов при НМРЛ по сравнению с патологически неизмененным эпителием бронхов и альвеол имеет дифференциально-диагностическое значение при исследовании патогистологического материала из легкого. Аналогичные результаты получены нами при исследовании эпителиальных опухолей толстой кишки, желудка, гладкомышечных опухолей матки [9, 18, 19].

ИП Ag-ЯОР-белков в клетках НМРЛ был связан с рядом клинико-морфологических параметров по системе TNM: показателями Т, N, размером первичной опухоли, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. В ряде исследований получены аналогичные выводы при исследовании ядрышковых организаторов при раке легкого [13—15]. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного, объективного дифференциально-диагностического критерия при НМРЛ.

КВ Ag-ЯОР-белков в клетках НМРЛ был связан с показателем Т, размером первичной опухоли, гистогенезом и дифференцировкой опухоли, что отражает нарастание гетерогенности клеточных популяций внутри опухоли в отношении синтеза рРНК и, вероятно, скорости прохождения фаз клеточного цикла клетками. В доступной литературе единичные исследования посвящены изучению КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток опухоли [20—22]. В этих исследованиях на материале железистого рака молочной железы и плоскоклеточного рака полости рта также показана взаимосвязь гетерогенности (КВ Ag-ЯОР-белков) ядрышковых организаторов с важнейшими клинико-морфологическими параметрами по системе TNM. Кроме того, с целью стандартизации и воспроизводимости результатов исследования ядрышковых организаторов необходимо использовать компьютерный анализ изображений совместно с внутренним контролем окрашивания (ИП Ag-ЯОР-белков) и показателем гетерогенности (КВ Ag-ЯОР-белков).

Выживаемость больных НМРЛ с –ИП или –КВ достоверно выше по сравнению с опухолями с +ИП или +КВ. Такая взаимосвязь количественного содержания и гетерогенности ядрышковых организаторов с выживаемостью больных со злокачественными опухолями прослежена и в других исследованиях [11—15, 20—22]. По данным литературы, взаимосвязь активности ядрышковых организаторов с выживаемостью больных карциномой разных органов и гистогенеза значительно чаще прослеживается при определении площади Ag-ЯОР-белков с помощью компьютерного анализа изображений, чем при визуальном подсчете количества Ag-ЯОР-белков.

В зависимости от взаимного содержания ИП и КВ Ag-ЯОР-белков выделены четыре типа НМРЛ: –ИП/–КВ, –ИП/+КВ, +ИП/–КВ, +ИП/+КВ. В нашем исследовании не получено статистически значимого различия в выживаемости больных с типами опухоли –ИП/+КВ и +ИП/–КВ. Поэтому эти два типа были объединены в один, при котором выживаемость достоверно различалась от –ИП/–КВ и +ИП/+КВ типов и имела промежуточное значение. Этот факт указывает на влияние гетерогенности ядрышковых организаторов на выживаемость больных и уточняет прогностическую значимость данного исследования.

При проведении многомерного регрессионного анализа показатель N, размер опухоли, гистогенез, КВ Ag-ЯОР-белков имели независимое влияние на выживаемость больных НМРЛ. Многочисленные исследования, посвященные изучению активности ядрышковых организаторов в злокачественных опухолях, также указывают, что содержание Ag-ЯОР-белков является независимым фактором прогноза [11—15, 20—22]. При НМРЛ с отсутствием метастазов в лимфатических узлах выживаемость больных была связана с размером и гистогенезом опухоли, а при наличии метастазов   с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли. Вероятно, выживаемость больных НМРЛ без метастатического потенциала в большей степени связана со скоростью роста первичной опухоли (локальным увеличением размера), а с появлением метастатического потенциала — с гетерогенностью биосинтетической функции популяции раковых клеток.

Таким образом, исследование количественных показателей и гетерогенности ядрышковых организаторов имеет дифференциально-диагностическое и прогностическое значение при НМРЛ.

Выводы

1. ИП Ag-ЯОР-белков в НМРЛ связан с важнейшими клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателями Т, N, размером первичной опухоли до 3 см и более, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. КВ Ag-ЯОР-белков взаимосвязан с показателем Т, размером первичной опухоли до 3 см и более, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного, объективного дифференциально-диагностического критерия при разграничении клинико-морфологических параметров по системе TNM в НМРЛ.

2. Выживаемость больных НМРЛ лучше при опухолях с низким ИП или КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с опухолями с высоким ИП или КВ Ag-ЯОР-белков.

3. Выживаемость больных НМРЛ высокая при опухолях с низким ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (тип –ИП/–KВ), низ-кая — с высоким ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (тип +ИП/+KВ), промежуточная — с противоположными значениями ИП и КВ Ag-ЯОР-белков (типы –ИП/+KВ и +ИП/–KВ).

4. Показатель N, размер опухоли, гистогенез, КВ Ag-ЯОР-белков — независимые факторы прогноза при НМРЛ. При НМРЛ с отсутствием метастазов в лимфатических узлах выживаемость больных связана с размером опухоли и гистогенезом, а при наличии метастазов — с КВ Ag-ЯОР-белков и размером опухоли.

Участие авторов:

Сбор и обработка материала: А.М.А., И.П.Б., Н.М.К., Е.Ю.Б., С.А.Л., А.Ф.Л.

Статистическая обработка: Д.С.К.

Написание текста: Д.С.К.

Редактирование: Е.Л.Л., Л.М.Н.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.