Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. В связи с развитием персонализированного подхода к выбору тактики лечения онкологических больных важное значение имеют не только клинические характеристики пациента, гистологический тип и степень злокачественности опухоли, но и ее молекулярно-генетические особенности.

Группа немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) составляет 80% всех раков легкого. Среди гистологических типов НМРЛ выделяют: аденокарциному, плоскоклеточный рак, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два типа составляют 80—90% всех НМРЛ.

По данным литературы, частыми молекулярно-генетическими изменениями в НМРЛ считаются внутригеномные перестройки микросателлитных ДНК: потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МН) в хромосомных регионах 2p23.3~p24.3 и 2q35; 3p14 и 3p21~p26 (50—80% всех НМРЛ); 9p21~p22; 17p13.1~p13.2 (40% всех НМРЛ); 13q; 18q и 9q [1—6]. Другие исследования также показывают высокую частоту хромосомных нарушений в районах 1p, 2p, 2q, 3p, 6q, 7p, 9p, 12p, 16p, 17p, 17q, 19p и 21q. Эти нарушения более характерны для опухоли, чем для прилегающих морфологически условно нормальных тканей [7—12].

Несмотря на большое число исследований, данные об ассоциации генетических изменений и клинико-морфологических параметров немногочисленны. Так, R. Tseng и соавт. [4] показали, что ПГ локуса 1p36.23 ассоциирована с курением, плоскоклеточным раком и поздней стадией опухолевого процесса. В исследовании M. Wrage и соавт. [13] ПГ в районе 4q, в частности 4q12—q23, НМРЛ статистически достоверно ассоциирована с метастазами в костях и головном мозге, и, вероятно, аллельные делеции в районе 4q могут запускать механизм ранней гематогенной диссеминации опухолевых клеток.

Рак легких характеризуется разнообразными генетическими изменениями, затрагивающими гены-супрессоры опухолевого роста и такие онкогены, как HLJ1 (1p31), FHIT (3p14), p16INK4a (9p21), RASSF1A, FUS1, LIMD1, SEMA3B, SEMA3F (3p21) и p53 (17p13) [14—18]. Показано, что для каждого гистологического типа существует свой характерный профиль генетических изменений. Так, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK, хромосомные перестройки в регионах 2p, 9p, 14q, 20p характерны для аденокарцином легкого [4, 11, 19], а для плоскоклеточного рака легкого — амплификация генов FGFR1 и SOX2 [20], а также хромосомные перестройки в районах 3p и 17p [14, 21].

Рассмотрим подробнее данные по отдельным генам, нарушения которых характерны для НМРЛ.

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), известный как HER1 или ErbB1, относится к семейству рецепторов ErbB, в частности к подсемейству тирозинкиназных рецепторов (обладающих внутренней тирозинкиназной активностью): EGFR (HER1/ErbB1), HER2/c-neu (HER2/ErbB2), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4). EGFR играет важную роль в канцерогенезе и прогрессировании опухоли посредством различных механизмов активации: гиперэкспрессии белка, соматических мутаций в гене EGFR и аутокринной продукции лиганда рецептора. Нарушения в гене EGFR вызывают активацию Ras/Raf/Mek/Mapk и PI3K/Akt/mTOR-сигнальных путей, что приводит к пролиферации опухолевых клеток, увеличению их объема, инвазивному росту, метастазированию и стимуляции опухолевого ангиогенеза [22]. Мутации в гене EGFR встречаются в 15-40% случаев НМРЛ.

18—21 экзоны гена EGFR кодируют тирозинкиназный домен рецептора, и мутации в любом из этих регионов определяют чувствительность к терапии низкомолекулярными ингибиторами EGFR (гефитиниб, эрлотиниб). Наиболее распространенными мутациями являются делеции в 19-м экзоне и мутация p.L858R в 21-м экзоне гена EGFR, реже встречаются мутации в 18-м и 20-м экзонах этого гена [23—25]. По данным различных исследований, мутации в гене EGFR характерны для аденокарцином, чаще встречаются в азиатской популяции, у женщин, некурящих [26—28].

Ген KRAS — протоонкоген, кодирующий одноименный белок, который является представителем белков семейства Ras. Белок KRAS представляет собой ГТФазу и является компонентом многих сигнальных путей. Мутации в гене KRAS встречаются у 15—35% пациентов с НМРЛ [29]. Наиболее частыми являются мутации в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS (90%); мутации в 10-м и 61-м кодонах встречаются редко [30]. Мутации гена KRAS характерны для аденокарцином легкого, чаще встречаются у европеоидов, чем азиатов (30 и 5%), и ассоциированы с курением [31—33]. Согласно данным литературы, наличие мутации в гене KRAS считается неблагоприятным фактором прогноза. Метаанализ данных показал, что мутации в этом гене ассоциированы со снижением выживаемости пациентов, а также неэффективностью терапии ингибиторами EGFR первого поколения (гефитиниб, эрлотиниб) [32].

Ген BRAF кодирует одноименную серин/треониновую протеинкиназу. BRAF-киназа является членом семейства киназ Raf. BRAF функционирует в сигнальном каскаде ниже Ras, от которого он передает сигналы на MАР-киназу [34]. Мутации в гене BRAF изначально исследовались только в контексте злокачественных меланом. Однако мутации в гене BRAF встречаются в 3% случаев НМРЛ [35]. При этом в отличие от меланом, при которых в подавляющем большинстве случаев выявляется мутация p.V600E, при НМРЛ встречаются различные мутации BRAF, например, p.G468A и p.L596V [35, 36].

Ген PIK3CA кодирует каталитическую субъединицу, которая участвует в процессах фосфорилирования ATФ и является участником PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути. Мутации в гене PIK3CA встречаются примерно в 5% плоскоклеточных раков легкого и в настоящее время являются объектом активных клинических исследований [37]. Сигнальный путь PI3K/Akt/mTOR играет важную роль в пролиферации клеток, синтезе белков и ангиогенезе [38]. Основным фактором, лимитирующим активность данного пути, является ген PTEN, ключевой ген-супрессор опухолевого роста. Делеции или инактивирующие мутации в гене PTEN приводят к усилению экспрессии гена PI3KCA, что активирует PI3K/Akt/mTOR-сигнальный путь. Инактивация гена PTEN является маркером неблагоприятного прогноза для пациентов с НМРЛ [39].

В последнее время все больше внимания уделяется гену ALK, кодирующему одноименную тирозиновую киназу. 5—13% случаев аденокарцином легкого имеют транслокацию и/или химерный ген EML4-ALK. Данный химерный ген образуется при инверсии в коротком плече хромосомы 2, которая соединяет 1—14-й экзоны гена EML4 с 20—29-м экзонами гена ALK [40]. Это приводит к постоянной активации сигнального пути ALK, который в итоге активирует ключевые регуляторы клеточного деления, такие как MAP-киназу и PI3K. Несмотря на то что описанные эффекты являются фенотипически сходными с мутациями EGFR, мутации ALK практически никогда не сочетаются с мутациями EGFR и KRAS и характерны для пациентов молодого возраста и некурящих. Доклинические исследования показали, что клетки, дефектные по гену ALK, являются очень чувствительными к блокаде данного гена ингибиторами ALK (кризотиниб) [41].

ROS1 — интегральный мембранный белок I типа, кодируемый геном ROS1, обладающим тирозинкиназной активностью. Недавние исследования выявили наличие транслокации гена ROS1, а также некоторые химерные варианты этого гена в НМРЛ. Частота этих изменений невелика и составляет 1,5—2%, однако показано, что данные изменения характерны для аденокарцином относительно молодых пациентов и некурящих [42—44]. Опухоли, имеющие транслокации и/или химерные варианты гена ROS1, хорошо реагируют на применение ингибиторов ALK (кризотиниб) [45].

c-MET — протоонкоген, который кодирует белок MET, также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), обладающий тирозинкиназной активностью. Активация MET при НМРЛ коррелирует с неблагоприятным прогнозом: активным опухолевым ростом и ангиогенезом, метастазированием. Амплификация c-MET встречается у 20—22% пациентов, получавших таргетную терапию, и у 3% больных, не получавших лечение. Амплификация и экспрессия этого гена вызывают резистентность к низкомолекулярным ингибиторам EGFR. Резистентность развивается с помощью HER3-опосредованной активации PI3K/Akt-сигнального пути [46, 47].

FGFR1 — тирозинкиназный рецептор, лиганды которого являются членами семейства факторов роста фибробластов. По данным J. Weiss и соавт. [48], амплификация гена FGFR1 обнаружена примерно в 20% плоскоклеточных раков легкого.

HER2 (ErbB2) — мембранный белок, тирозиновая протеинкиназа семейства рецепторов ErbB. Известно, что амплификация гена HER2 характерна для инвазивного рака молочной железы. Однако рядом исследований показано, что амплификация этого гена также встречается в небольшом проценте НМРЛ (4%) [49, 50]. Согласно данным других исследований, примерно в 3% НМРЛ обнаружены мутации в 18—21 экзонах гена HER2, характерные для женщин, некурящих и аденокарцином легкого [51—53]. При проведении исследования мутаций гена HER2 на специальной выборке (некурящие пациенты с аденокарциномой и аденоплоскоклеточным раком легкого, диким типом гена EGFR) количество пациентов с мутациями возрастало до 14% [52]. В настоящее время активно изучается применение анти-HER2-терапии для пациентов с НМРЛ.

Представленные структурные изменения позволяют понять, что в НМРЛ происходят многочисленные мутационные события, затрагивающие различные участки генома, и оценить возможность использования молекулярно-генетических изменений в НМРЛ для назначения соответствующей таргетной терапии и определения прогноза заболевания. Так, определение мутаций в гене EGFR показано при назначении таргетной терапии ингибиторами EGFR, наличие транслокации EML4/ALK ассоциировано с чувствительностью к терапии кризотинибом (см. таблицу).

Эпигенетические изменения — это изменения регуляции экспрессии гена. Эпигенетическая регуляция отвечает за нормальное функционирование гена и за стабильность генома в целом, и ее нарушения играют ключевую роль в развитии и прогрессировании многочисленных типов опухоли. Наиболее изученными эпигенетическими нарушениями являются посттрансляционная модификация ДНК и гистонов, изменения уровня экспрессии микроРНК. Поскольку эпигенетические нарушения потенциально обратимы, существует возможность их применения в качестве потенциальной стратегии лечения рака.

Данные многочисленных исследований показывают, что для НМРЛ характерно метилирование промоторов большого числа генов, таких как p16, RASSF1A, APC, RARb-2, CDH1, CDH13, DAPK, MGMT, ASC/TMS1, FHIT, hSRBC, TSLC1, DAL-1, PTEN [21, 54]. Эти гены отвечают за регуляцию клеточного цикла опухолевой клетки, пролиферацию, апоптоз, клеточную адгезию, мобильность опухолевой клетки и репарацию ДНК. Наряду с генетическими механизмами аномальное метилирование ДНК обеспечивает механизм инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к возникновению и прогрессированию рака легкого.

M. Ji и соавт. [55] проводили анализ метилирования промоторов 6 генов (CALCA, CDH1, DAPK1, IRX2, TIMP3, PAX6) на 96 образцах опухоли и 15 образцах нормальной ткани легкого от пациентов с НМРЛ. Авторы выявили 100% специфичность гиперметилирования промотора каждого из 6 генов, чувствительность метилирования промотора составила в среднем для CALCA — 69%, CDH1 — 46%, DAPK1 — 84%, IRX2 — 52%, TIMP3 — 45%, PAX6 — 76%. При выявлении ассоциаций между полученными эпигенетическими нарушениями и клинико-патологическими характеристиками пациентов было получено, что гиперметилирование промоторных регионов генов CDH1, DAPK1, IRX2 и TIMP3 ассоциировано с плоскоклеточным раком легкого, метилирование DAPK1 ассоциировано с метастазами в лимфатических узлах (p<0,05), частота гиперметилирования промотора гена CALCA достоверно выше у пациентов с опухолевым процессом (III—IV стадии), инвазивным ростом опухоли и курением (p<0,05) [55].

Показано, что в НМРЛ (аденокарциномах и плоскоклеточных раках) частота метилирования промотора генов p16, MGMT, RASSF1A, MTHFR и FHIT выше у курильщиков [56, 57], а частота метилирования промотора генов RASSF2, TNFRSF10C, BHLHB5 и BOLL — у некурящих пациентов [58]. Метилирование генов RASSF1A, APC, ESR1, ABCB1, MT1G и HOXC9 ассоциировано с I стадией опухолевого процесса, а эпигенетические изменения генов hDAB2IP, H-cadherin, DAL-1 и FBN2 характерны для III—IV стадии рака легкого [59, 60].

S. Begum и соавт. [61] провели многоэтапное исследование аномального метилирования генов на материале плазмы крови пациентов с НМРЛ. На первом этапе авторы определяли чувствительность метода для определения метилирования промоторов 15 генов (APC, AIM1, Cyclin D2, CALCA, CDH1, DCC, p16, MGMT, RASSF1A, MINT31, Cyclin A1, ESR1, HIC1, PGP9.5 и TIMP3) в опухоли и соответствующей ДНК в сыворотке крови у 10 пациентов с НМРЛ. На основании результатов первого этапа исследования было выбрано 6 генов (APC, CDH1, MGMT, DCC, RASSF1A, AIM1) с наибольшей частотой эпигенетических нарушений. На втором этапе исследования авторы проводили оценку эпигенетических изменений выбранной панели генов в сыворотке крови у 76 пациентов с НМРЛ и у 30 здоровых пациентов.

В результате проведенного исследования авторы показали, что метилирование промотора хотя бы одного из 6 генов в панели выявлено в 84% (64/76) случаев. В группе здоровых пациентов частота аномального метилирования составила 20% (6/30). 100% специфичность в данном исследовании получена для гена DCC, метилирование которого было выявлено только у пациентов с НМРЛ [61]. Данное исследование показывает, что большое количество генов характеризуется аномальным метилированием в НМРЛ и ассоциировано с клиническими параметрами пациента.

Приведенные исследования раскрывают большие перспективы для оценки эпигенетических нарушений в НМРЛ и определения их значимости в клинической практике.

МикроРНК — класс некодирующих одноцепочечных РНК, имеющих длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации матричной РНК (мРНК). Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микроРНК с частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках мРНК («мишенями»). МикроРНК — тканеспецифичны и играют важную роль в процессах развития и дифференцировки тканей и органов. Показано, что при различных заболеваниях, в том числе онкологических, происходит изменение уровня экспрессии микроРНК [62]. Из-за их фундаментальной роли в развитии и дифференцировке клеток, их причастности к биологическим механизмам, лежащим в основе канцерогенеза, а также их простого строения, стабильности и доступности обнаружения, они представляют собой многообещающий класс биомаркеров рака.

Различные уровни экспрессии микроРНК в НМРЛ могут быть предиктивными и прогностическими маркерами и специфичными для определенного гистологического типа НМРЛ. Например, такие микроРНК, как miR-126, miR-31, miR-519c, Let-7a, miR-133B, miR-15a, miR-16 и miR-183, участвуют в регуляции пролиферации, миграции и инвазии клеток при НМРЛ, воздействуя на специфические «мишени»: Crk, EGFL7, VEGF, LATS2, PPP2R2A, HIF-1a, NIRF, MCL-1, BCL2L2, циклины D1, D2, E1 и Ezrin [21, 63—69]. Выявлено, что экспрессия микроРНК Has-miR-205 является специфическим маркером плоскоклеточного рака легкого [70, 71]. Считается, что гиперэкспрессия miR-21, miR-146b, miR-155 в опухоли является неблагоприятным прогностическим маркером, ассоциированным с низкой выживаемостью пациентов с НМРЛ [72—74]. Другие исследования показали, что снижение уровня экспрессии let-7 и miR-34 и гиперэкспрессия miR-221, miR-137, miR-372 и miR-182* ассоциированы с рецидивом заболевания у пациентов с НМРЛ [75—77].

В 2008 г. P. Mitchell и соавт. [78] показали, что циркулирующие в крови микроРНК являются стабильными маркерами рака. Было выявлено наличие микроРНК в образцах плазмы и сыворотки крови и показано, что эти молекулы довольно стабильны даже при многократном замораживании и размораживании. Циркулирующие микроРНК могут быть перспективными маркерами рака, что подтверждается большим количеством исследований в этом направлении.

Для успешного обнаружения молекулярно-генетических изменений необходимы современные и точные методы. Одним из таких новых методов является секвенирование следующего поколения. Секвенирование следующего поколения — это высокопроизводительный метод, позволяющий синхронизировать процесс секвенирования, производя тысячи или миллионы последовательностей одновременно. По сравнению с классическими молекулярно-генетическими анализами, секвенирование следующего поколения может быть полезным в определении клональности опухоли, особенно при невозможности определения мутаций при помощи классических методов. Вследствие работы с малыми фрагментами ДНК метод секвенирования следующего поколения позволяет получить информацию о многих генах одновременно, даже при цитологических образцах или маленьких биоптатах, проводиться на ДНК, выделенной из парафиновых блоков, и определять аллельные варианты с низкой частотой (5%). Для определения мутаций с использованием «традиционного» секвенирования необходим образец с 40—50% опухолевых клеток, в то время как для секвенирования следующего поколения достаточно и 10%.

Одним из показательных примеров применения современных молекулярно-генетических методов последнего поколения является появление большого числа работ, посвященных мультифокальному НМРЛ. По данным статистики, около 5—8% случаев НМРЛ являются мультифокальными [79—82]. Различие мультифокальных опухолей, происходящих из одного клона, и первично-множественных опухолей важно для назначения адекватного лечения, так как лечение пациентов с первично-множественными опухолями дает лучший результат, чем у пациентов с мультифокальными опухолями [83]. Секвенирование следующего поколения позволяет определить уникальные молекулярные профили опухолей. Сравнение исследуемых генетических профилей между собой позволяет разделить мультифокальные и первично-множественные раки [79, 82—85].

В настоящее время исследования в области молекулярной биологии НМРЛ позволяют понять и оценить возможности применения существующих генетических нарушений в клинической практике. Так, разработка тест-систем на основе молекулярно-генетических маркеров позволит улучшить раннюю диагностику и обеспечить более точный прогноз заболевания у пациентов с НМРЛ.

Открытие новых маркеров таргетной терапии имеет большое значение для лечения и прогноза заболевания у пациентов с НМРЛ. Изучение сигнальных путей и молекулярных механизмов НМРЛ позволит расширить применение таргетной терапии. Разработка таргетных препаратов к таким «мишеням», как Alk, c-Met, mTor и PI3K, наряду с пониманием необходимости одновременного блокирования альтернативных путей передачи сигнала в опухолевой клетке и преодолением вторичной резистентности могут обеспечить персонифицированное лечение пациентов с НМРЛ.