Высокомолекулярный гликопротеид MUC1 относится к семейству мембранно-связанных муцинов, которые играют важную роль в физиологических и патофизиологических процессах в организме человека [3]. В норме MUC1 продуцируется дифференцированными клетками однослойного секреторного эпителия органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы, эпителия дистальных канальцев и собирательных трубочек почек, уротелием и локализуется на апикальной мембране. В связанной с мембраной, а также в свободной секреторной форме MUC1 обеспечивает защиту поверхности клеток от повреждающих факторов внешней среды и бактериальной инвазии [15].

MUC1 обнаружен на клетках-предшественниках костного мозга, активированных лимфоцитах и дендритных клетках, где он, как полагают, участвует в процессах адгезии, локомоции и задействован в регуляции внутриклеточных сигналов [9, 22].

Экспрессия MUC1 характерна для клеток большинства злокачественных опухолей эпителиального происхождения. По современным представлениям, увеличение экспрессии MUC1, деполяризация его распределения на плазматической мембране, а также появление незрелых углеводов в структуре молекулы способствуют формированию биологически агрессивного фенотипа опухолевых клеток и прогрессии новообразования [3, 5].

Повышенное содержание MUC1-ассоциированых антигенов (СА15-3, СА27.29, KL-6 и др.) детектируется в кровотоке больных раком молочной железы [6, 19, 20], предстательной железы [8], поджелудочной железы [10], при гепатоцеллюлярном раке [18], а также при некоторых новообразованиях гемопоэтической ткани [21]. Значительно повышенный уровень MUC1 в сыворотке крови наблюдается, как правило, на фоне прогрессирования заболевания.

В последние годы возрос интерес к MUC1-ассоциированым антигенам, присутствующим в кровотоке при раке легкого. По данным R. Мolina и соавт. [17], CA15-3, преимущественно ассоциированный с аденогенными опухолями, может быть полезен в сочетании с другими серологическими маркерами для уточнения гистогенеза опухоли легкого у неоперабельных больных. У больных раком легкого, получающих терапию ингибиторами эпидермального фактора роста, содержание CA15-3 и KL-6 в сыворотке крови коррелирует с клиническим эффектом лечения [4, 7].

Сравнительный анализ опубликованных данных по содержанию MUC1 в сыворотке крови у больных раком легкого [11—14, 17] осложняется неодинаковыми критериями формирования клинических групп, а также зависимостью информативности результатов как от моноклональных антител (МКА), которые используются для детекции антигена, так и от выбранного дискриминационного уровня (ДУ) маркера.

Настоящее исследование выполнено с применением тест-системы, разработанной на основе оригинального МКА ИКО25, полученного к MUC1 из мембран жировых глобул женского молока [1] и взаимодействующего с сиалированным гликопептидным эпитопом муцина. Следуя принятой традиции в иммунохимических исследованиях MUC1, муцин, детектируемый МКА ИКО25, мы обозначаем как ИКО25-реактивный MUC1 (М/ИКО25).

Цель настоящей работы — оценка потенциальной клинической значимости М/ИКО25 как серологического маркера у больных раком легкого.

Исследованы образцы сыворотки крови у 62 здоровых лиц (35 мужчин и 27 женщин в возрасте от 20 до 60 лет, медиана 40 лет) и 286 больных, проходивших обследование и лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена в 2008—2010 гг.

Диагноз у больных установлен на основании данных инструментальных и морфологических методов исследования (рентген-диагностика, бронхофиброскопия, ультразвуковая и радионуклидная диагностика, компьютерная томография, цитологическое исследование пунктатов патологически измененных тканей и скарификатов слизистой оболочки бронхов, гистологическое исследование биоптатов и/или тканей, удаленных при хирургическом вмешательстве).

У 52 пациентов диагностировано незлокачественное заболевание легких (НЗЛ, 30 мужчин и 22 женщины в возрасте от 43 до 65 лет, медиана 52 года). Из них доброкачественная опухоль легкого диагностирована у 6 больных (фиброма — у 3, хондрогамартома — у 2, киста — у 1), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) — у 6, пневмофиброз — у 9, туберкулез и посттуберкулезные изменения — у 8, пневмония — у 12, абсцесс легкого — у 3, саркоидоз — у 8.

У 234 больных верифицирована злокачественная опухоль легкого (186 мужчин и 48 женщин в возрасте от 19 до 84 лет, медиана 61 год). Стадия заболевания установлена в соответствии с Международной классификацией по системе TNM (2004 г.), гистологический тип — в соответствии с Международной гистологической классификацией (2004 г.). Распределение больных в соответствии со стадией заболевания и гистологическим типом опухоли представлено в табл. 1.

Исследование проводили в образцах сыворотки периферической крови, полученных до начала специфического лечения.

Получение реагентов. МКА ИКО25 выделяли из асцитической жидкости мышей BALB/C с привитой гибридомой ИКО25 (депонирована в лаборатории экспериментальных моделей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, №ВСКК/П/465Д). Конъюгат МКА ИКО25 с биотином (ИКО25-биотин) получали с использованием N-гидроксисукцинимидного эфира D-биотиноил-ε-аминокапроновой кислоты («Roche», Германия).

Муцин MUC1 выделяли из плазмы женского молока методом иммуноаффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В («Pharmacia Biotech», Швеция), конъюгированной с МКА ИКО25 по общепринятой методике.

Определение уровня MUC1 осуществляли методом ингибиторного иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип теста основан на конкурентном взаимодействии ИКО25-биотин с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, и антигеном, находящимся в растворе. MUC1 иммобилизовали в забуференном физиологическом растворе рН 7,4 (ЗФР) на планшетах для ИФА («Costar», США). В ячейки планшета вносили калибровочные растворы MUC1, образцы тестируемых сывороток крови и внутренних контролей (образцы пуловой сыворотки крови), затем во все ячейки вносили раствор ИКО25-биотин. Для разведений использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ЗФР. Нулевой пробой служил буфер для разведений, в качестве трейсера использовали конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена («BD Pharmigen», США), в качестве хромогена — раствор 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ, «Sigma-Aldrich», США). Пробы на планшеты наносили в триплетах. Все инкубации выполняли при комнатной температуре (18—24 °С). Тест-система валидирована в соответствии с требованиями ГОСТ [2].

Количество ИКО25-реактивного MUC1 в образцах (Ед/мл) рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием растворов MUC1 в концентрации от 6 до 200 Ед/мл. М/ИКО25 является близким аналогом СА15-3. Единицы измерения М/ИКО25 соответствуют единицам измерения СА15-3 в наборе CanAg CA15-3 EIA («CanAg Diagnostics», Швеция).

Статистический анализ данных. Расчет статистических характеристик проводили с использованием программы Statistica. Значимость различий между группами по величине уровня М/ИКО25 оценивали с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни (U-тест), по частоте встречаемости повышенного уровня М/ИКО25 — с использованием точного теста Фишера или критерия Пирсона (χ²-тест), в зависимости от количества наблюдений в группах. Различия считали достоверными при р≤0,05.

Результаты определения уровня M/ИКО25 в группах доноров, больных с НЗЛ и злокачественными опухолями легкого представлены на рис. 1.

В сыворотке крови доноров содержание M/ИКО25 варьировало от 14 до 37 Ед/мл, в среднем составляло 25±7 Ед/мл (разброс — величина стандартного квадратичного отклонения), медиана 25 Ед/мл. Статистически значимых различий по величине показателя между группами, отличающимися по полу и возрасту, не выявлено.

В соответствии с вариацией уровня M/ИКО25 в сыворотке крови доноров установлен ДУ 40 Ед/мл (ДУ40), рассчитанный как сумма средней величины и удвоенной величины стандартного квадратичного отклонения показателя. Содержание M/ИКО25 в сыворотке крови, равное или превышающее ДУ40, расценивали как повышенное. Для сравнительной оценки степени увеличения сывороточного содержания M/ИКО25 в группах пациентов введен дополнительный ДУ 60 Ед/мл (ДУ60).

В группе НЗЛ повышенный уровень M/ИКО25 в сыворотке крови наблюдался у 21,2% больных, преимущественно при пневмонии и саркоидозе (табл. 2).

Группа больных со злокачественными опухолями легкого отличалась от группы больных с НЗЛ как более высокой частотой повышенного уровня M/ИКО25 (р<0,0001, χ²-тест), так и более высокими значениями показателя в целом (р<0,0001, U-тест).

Результаты серологического исследования в данной группе больных анализировали в зависимости от стадии заболевания, формы роста опухоли (периферическая и центральная), особенностей первичного очага и уровня поражения регионарных лимфатических узлов (критерии стадирования T и N соответственно). Принимая во внимание, что экспрессия MUC1 на клетках преимущественно ассоциирована с опухолями аденогенного происхождения, анализ по гистологическому типу новообразования проводили дифференцированно.

Плоскоклеточный рак (ПКР) и аденокарцинома (АК) легкого составляли наиболее многочисленную группу больных (табл. 3).

Как видно из данных, приведенных в табл. 3, общая частота повышенного уровня M/ИКО25 в группе больных ПКР сопоставима с таковой в группе больных с АК (р=0,192, χ²-тест). При этом доля больных с уровнем M/ИКО25, превышающим ДУ60, в группе больных с АК достоверно выше, чем у больных ПКР (р<0,001, χ²-тест), и как следствие величины показателя при АК в целом выше, чем при ПКР (р=0,015, U-тест). Эти различия главным образом обусловлены высокой частотой значительно повышенного уровня M/ИКО25 среди больных с АК IV стадии, тогда как при I—III стадии рака легкого распределение величины показателя относительно ДУ40 и ДУ60 при АК и при ПКР было сходным (рис. 2).

Отмечено, что среди больных с аденокарциномой, у которых верифицирован бронхиолоальвеолярный рак (I стадия — 7, II—III — 2), содержание M/ИКО25 в сыворотке крови превышало ДУ40 только у 1 (11%, I стадия) из 9 больных. Среди остальных больных с аденокарциномой доля пациентов с повышенным значением показателя при I стадии составила 40%, при II—III — 66,7%.

Доминирование в группе АК больных с периферической локализацией новообразования (68, 85%) затрудняло достоверную оценку зависимости уровня M/ИКО25 от формы роста опухоли. Медиана распределения и частота повышенного уровня M/ИКО25 при периферической и центральной локализации АК существенно не различались.

В группе больных ПКР обнаружено, что уровень M/ИКО25 достоверно выше среди больных с центральной (цПКР, n=53), чем среди больных с периферической (пПКР, n=52) формой роста опухоли (рис. 3).

В целом при периферической локализации АК или ПКР легкого степень увеличения уровня M/ИКО25 в сыворотке крови не коррелировала с опухолевым поражением плевры. Среди больных, сопоставимых по гистологическому типу опухоли, стадии заболевания и клинико-анатомической форме роста новообразования не выявлено зависимости между величиной показателя и степенью дифференцировки опухоли. Не найдено достоверных корреляций между повышенным уровнем M/ИКО25 в сыворотке крови и полом, возрастом пациентов, сопутствующими неопухолевыми заболеваниями легких, органов желудочно-кишечного тракта, носительством вируса гепатита В или С.

Результаты исследования уровня M/ИКО25 в сыворотке крови у больных с другими гистологическими типами злокачественных опухолей легкого представлены в табл. 3.

При аденоплоскоклеточном раке легкого содержание M/ИКО25 в сыворотке крови, превышающее ДУ40, выявлено у 2 из 5 больных при I стадии заболевания (40%, величина показателя варьировала от 33 до 58 Ед/мл), у 3 из 6 — при II—III стадии (50%, 22—85 Ед/мл) и у 4 из 5 при IV стадии (80%, 38—200 Ед/мл). По частоте повышенного содержания М/ИКО25 эта группа в большей степени сопоставима с группой АК, чем с группой ПКР.

У 3 больных крупноклеточным раком легкого детектировался значительно повышенный уровень M/ИКО25, превышающий ДУ60. У всех этих больных заболевание диагностировано на III или IV стадии.

У 7 больных, у которых морфологически установлен анапластический рак, выявлен местно-распространенный или метастатический опухолевый процесс. Уровень M/ИКО25, превышающий ДУ40, отмечен у 55,6% пациентов.

В группе больных, у которых верифицирован карциноид легкого, выявлена сравнительно низкая частота повышенного уровня M/ИКО25 в сыворотке крови.

У большинства этих пациентов клинически установлена I стадия заболевания, однако однозначной корреляции между распространенностью опухоли и величиной показателя не наблюдалось. Так, сывороточный уровень M/ИКО25, превышающий ДУ40, детектировался у 3 (27,3%) из 11 больных при I стадии и у 1 (25%) из 4 пациентов при местно-распространенном опухолевом процессе, а у 2 больных при IV стадии заболевания показатель не превышал ДУ40.

У 4 больных мелкоклеточным раком легкого (II—III стадия) детектировался повышенный уровень M/ИКО25.

Среди всех больных, у которых была диагностирована IV стадия рака легкого, не выявлено зависимости между степенью увеличения содержания M/ИКО25 в сыворотке крови и локализацией отдаленных метастазов.

Таким образом, результаты настоящего исследования показывают, что повышенный уровень M/ИКО25 в сыворотке крови наблюдается у значительной части больных со злокачественными опухолями легкого (49,6%), преимущественно при распространенной стадии заболевания, что согласуется с опубликованными данными серологических исследований [13, 14, 17].

Среди пациентов с НЗЛ высокая частота повышенного сывороточного уровня M/ИКО25 отмечается у больных саркоидозом, что также согласуется с опубликованными данными [16]. Среди больных ХОБЛ, пневмофиброзом, туберкулезом и пневмонией, а также с доброкачественными опухолями легких уровень M/ИКО25, превышающий 40 Ед/мл, наблюдался у 13,5% пациентов, а уровень, превышающий 60 Ед/мл, — только у 2,3%.

Относительно низкое содержание M/ИКО25 в сыворотке крови наблюдалось у пациентов при новообразованиях с относительно благоприятным прогнозом (бронхиолоальвеолярный рак, карциноид), что отличает их от других типов злокачественных опухолей легкого, характеризующихся более высокой биологической агрессивностью роста и метастазирования.

В целом в группе наблюдений, объединяющей немелкоклеточный рак легкого (ПКР, АК, аденоплоскоклеточный рак, крупноклеточный рак) и анапластический рак, частота повышенного уровня M/ИКО25 достоверно возрастала при распространенности опухолевого процесса в медиастинальные лимфатические узлы и отдаленных метастазах (рис. 4).

Значительная доля больных раком легкого, у которых содержание M/ИКО25 находится в пределах нормальных значений, делают M/ИКО25 слабым диагностическим маркером на этапе предоперационного обследования пациентов. В то же время при подтвержденном диагнозе злокачественной опухоли и при исключении сопутствующего интерстициального заболевания легких уровень M/ИКО25, превышающий 60 Ед/мл, может указывать на высокий риск скрытого метастатического процесса среди больных с АК и цПКР, у которых клинические методы обследования не выявляют признаков регионарного или отдаленного метастазирования. Полученные нами данные также свидетельствуют о том, что при клинической интерпретации результатов определения уровня M/ИКО25 у больных раком легкого необходимо учитывать не только гистологический тип новообразования, но и клинико-анатомическую форму роста опухоли.

Различные уровни циркулирующего M/ИКО25, наблюдаемые нами при цПКР и пПКР легкого, могут быть следствием сочетания факторов, связанных как с биологическими свойствами новообразований, так и с особенностями развития патологического процесса при центральной и периферической локализации опухоли. Среди этих факторов могут быть уровень экспрессии MUC1 в опухолевых клетках, характер кровоснабжения опухоли, степень вовлечения лимфатических сосудов в опухолевый процесс, строение лимфатических коллекторов, выраженность реактивных изменений окружающих тканей.

Таким образом, ИКО25-реактивный MUC1 как серологический маркер у больных раком легкого представляет интерес для изучения биологических особенностей опухолей легкого, а также для поиска и разработки дополнительных критериев уточняющей диагностики и прогноза заболевания.

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы.