Введение
Гипертрофическую кардиомиопатию (ГКМП) считают самым распространенным наследственным заболеванием сердца. Частота встречаемости этого заболевания в мире по последним оценкам составляет 1 случай на 200 человек [1]. За более чем полувековую историю изучения данной патологии стало очевидным, что ГКМП — крайне гетерогенное, с генетической точки зрения, заболевание [2, 3]. В настоящее время идентифицировано около 50 генов и 1500 мутаций в них, которые связаны с развитием ГКМП [4]. Несмотря на это, все известные патогенные мутации выявляют только у 60—72% пациентов с ГКМП с семейной историей заболевания и лишь у 10—50% пациентов без ГКМП в семейном анамнезе [5, 6]. В связи с этим по-прежнему является актуальным изучение распространенности патогенных мутаций, приводящих к развитию ГКМП. Особенно это актуально для российской популяции, где до сих пор не до конца изучен спектр патогенных мутаций в геноме, приводящих к развитию ГКМП.
В настоящее время основной причиной заболевания считают различные мутации в генах белков саркомера. При этом подавляющее большинство патогенных мутаций расположено в генах миозин связывающего белка C3 (MYBPC3) и тяжелой цепи миозина 7 (MYH7). В них выявляют до 70% всех мутаций, описанных при ГКМП [7, 8]. Более того, по некоторым оценкам, патогенные мутации в гене MYBPC3 встречаются несколько чаще [9]. Вероятно, это обусловлено тем, что одной из ключевых характеристик данного гена является достаточно большое количество «горячих точек» мутаций [10]. Одна из таких областей гена содержит 495 кодон, кодирующий в нормально функционирующем белке аминокислоту аргинин.
В связи с этим цель настоящей работы — в оценке вклада патогенных вариантов rs200411226 и rs397515905 в гене MYBPC3, приводящих к заменам R495Q, R495W и R495G, в развитие ГКМП в российской популяции.
Материал и методы
Пациенты были рекрутированы в кардиологическом отделении городской клинической больницы №52 Департамента здравоохранения Москвы (169 пациентов) и кардиохирургическом отделении хирургического лечения дисфункций миокарда и сердечной недостаточности ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» (54 пациента). Критерии отбора пациентов с ГКМП описаны ранее [11]. Выборка состояла исключительно из пробандов: родственников пациентов в выборку не включали. Средний возраст пациентов составил 58,4±14,5 года, соотношение полов было 108/115 (М/Ж). Клиническая характеристика исследованной выборки пациентов представлена в табл. 1. Письменное информированное согласие на участие в исследовании было получено от всех пациентов и членов их семей в соответствии с Хельсинкской декларацией. Исследование было одобрено этическим комитетом РНИМУ (протокол №139 от 10 ноября 2014 г.). Фенокопии ГКМП у всех пациентов были исключены [11].
Таблица 1. Клинические характеристики пациентов, вовлеченных в исследование
| Клиническая характеристика | N (мужчины) |
| Семейная история ГКМП | 21 (7) |
| Семейная история внезапной смерти | 40 (17) |
| Клиническая смерть | 0 |
| Использование имплантируемого кардиовертера-дефибриллятора (ИКД) | 5 (2) |
| Миоэктомия | 55 (29) |
| История внезапной остановки сердца: инфаркт миокарда | 31 (10) |
| Боль в груди: стенокардия, кардиалгия | 103 (44) |
| Синкопе/история синкопе | 31 (11) |
| Головокружение | 56 (23) |
| Одышка | 170 (80) |
| Шумы в сердце | 81 (38) |
| Трепетания | 81 (32) |
| Аномалии ЭКГ | 137 (64) |
| Гипертония | 92 (39) |
| Функциональный класс сердечной недостаточности: | |
| I | 52 (27) |
| II | 132 (65) |
| III | 38 (17) |
| IV | 3 (0) |
Примечание. N — число пациентов.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови описано ранее [11]. ПЦР проводили с использованием прибора QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) и реактивов для ПЦР («Синтол», «Евроген», «ДНК-Синтез»). В состав смеси для ПЦР входили: 0,2 мкл —Taq-полимераза (5 е.а./мкл), 3 мкл — буферный раствор (´10), 3 мкл — смесь дНТФ (по 25 нмоль/мкл), 3 мкл — MgCl2 (25 нмоль/мкл), 1 мкл — праймеры (10 пмоль/мкл), 1 мкл — зонды (5 пмоль/мкл), 5 мкл — ДНК (0,02 нг/мкл), до 30 мкл — бидеионизованная вода. Условия амплификации были следующими: 1) 180 с при 95 °C; и 2) 30 циклов по 15 с при 95 °C, 20 с при 60 °C. Все реакции повторяли троекратно для каждой ДНК.
Праймеры и зонды были подобраны на основе последовательности генома человека в базе данных NCBI (участок, содержащий пары нуклеотидов 47342601-47342840 в последовательности NC_000011.10, хромосома 11 Homo sapiens, первичная сборка GRCh38.p13). Последовательности праймеров и зондов доступны по запросу. Анализ генотипов проводили с помощью программного обеспечения QuantStudio Design and Analysis Software version 1.3 (Thermo Fisher Scientific). Статистическую обработку результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения MS Excel 2010 (Microsoft) и GraphPad InStat v3.10 (GraphPad Software, Inc.). Статистически значимыми считали значения p менее 0,05.
Результаты и обсуждение
В настоящей работе был проведен анализ распространенности патогенных мутаций rs200411226 (NM_000256.3:c.1484G>A) и rs397515905 (NM_000256.3:c.1483C>T/G) в гене MYBPC3 (R495Q, R495W и R495G) в выборке русских пациентов с ГКМП. Всего в данной работе было генотипировано 224 образца, полученных от пациентов с ГКМП разной степени тяжести. Нами было выявлено только две мутации R495Q и R495W в гетерозиготном состоянии у двоих пациентов из всей выборки (табл. 2). Частоты их встречаемости в нашей выборке составили 0,4% для каждой мутации. Частоты встречаемости таких патогенных мутаций в различных выборках пациентов с ГКМП достаточно низки и в силу малых размеров выборок варьируют между популяциями (см. табл. 2). При этом следует отметить, что частоты встречаемости мутации R495Q в различных выборках пациентов достаточно сильно разнятся: от 0,2% [12] до 7,7% [13], что отчасти можно объяснить малым размером выборок или их популяционными особенностями. Кроме того, на частоту выявляемости данных мутаций может влиять их неполная пенетрантность. Так, в работе I. Cristiaans и соавт. были выявлены несколько бессимптомных родственников пробандов носителей мутаций R495Q и R495G [14]. Тем не менее, усредненная встречаемость этих мутаций у пациентов с ГКМП в мире составляет 1 случай на 100 пациентов. Таким образом, частоты встречаемости мутации R495Q и R495W в нашей выборке сопоставимы с таковыми в других популяциях (см. табл. 2). Более того, поскольку у этих двух пациентов, носителей мутаций R495Q и R495W, выявлена ГКМП средней степени тяжести, можно сделать предположение о том, что изученные нами мутации, по-видимому, не приводят к тяжелому течению заболевания. Кроме того, нам не удалось выявить в нашей выборке пациентов с ГКМП патогенную мутацию R495G. Вероятно, данная мутация приводит к манифестации заболевания в более раннем возрасте и чаще встречается у детей [15, 16].
Таблица 2. Патогенные варианты в гене MYBPC3
| Патогенный вариант | Частота варианта в нашей выборке, N(%) | Частота варианта в других выборках, N(%) |
| rs200411226 (NM_000256.3:c.1484G>A, R495Q) | 1 из 224 (0,4) | 13 из 2178 (0,6) [19], 2 из 46 (4,3) [20], 1 из 586 (0,2, общая популяция) [12], 10 из 268 (3,7) [21], 1 из 122 (0,8) [22], 1 из 24 (4,2) [23], 1 из 18 (5,6) [24], 1 из 389 (0,3) [25], 3 из 223 (1,3) [26], 3 из 77 (3,9) [27], 1 из 83 (1,2) [14], 1 из 192 (0,5) [28], 1 из 13 (7,7) [13], 1 из 29 (3,4) [17] |
| rs397515905 (NM_000256.3:c.1483C>T, R495W) | 1 из 224 (0,4) | 2 из 150 (1,3) [29], 1 клин. случай атлета [30], 1 из 120 (0,8) [31], 1 из 130 (0,8) [32] |
| rs397515905 (NM_000256.3:c.1483C>G, R495G) | 0 | 1 из 84, возраст пациентов <18 лет, (1,2) [16], 1 из 82, возраст пациентов <18 лет, (1,2) [15], 1 из 83, 2 носителя без симптомов, (1,2) [14], 1 из 192 (0,5) [28] |
Примечание. N — число пациентов.
Как уже было сказано, S.P. Harris и соавт. предполагают, что локус, в котором локализованы изучаемые нами патогенные мутации, обладает характеристиками «горячей точки» мутаций [10]. Данный локус расположен в 17-м экзоне гена MYBPC3, кодирующем часть иммуноглобулин-C2-подобного домена C3 миозин-связывающего белка 3 [17]. Вероятно, изученные нами мутации могут опосредованно приводить к уменьшению количества головок миозина в суперрелаксированном состоянии и увеличению количества головок в дезорганизованном релаксированном состоянии (ДРС). Головки в ДРС способны связываться с актином, и большее их количество приводит к гиперсократимости саркомера и увеличенному потреблению АТФ, что в итоге формирует фенотип ГКМП [9, 18]. Однако на данный момент точный механизм влияния мутаций R495Q и R495W на сократимость саркомера не выяснен.
Заключение
В ходе настоящей работы была проведена оценка вклада патогенных вариантов rs200411226 и rs397515905 в гене MYBPC3, приводящих к заменам R495Q, R495W и R495G, в развитие ГКМП в российской популяции. Частоты встречаемости мутаций R495Q и R495W в нашей выборке составили 0,4% для каждой мутации. Таким образом, данные мутации сами по себе не вносят значительного вклада в развитие ГКМП в российской популяции. Тем не менее, они могут быть включены в панель патогенных вариантов для генетической диагностики ГКМП.
Финансирование. Работа поддержана Российским научным фондом (номер гранта 22-15-00243).
Соблюдение этических стандартов. Письменное информированное согласие на участие в исследовании было получено от всех пациентов и членов их семей в соответствии с Хельсинкской декларацией. Исследование было одобрено этическим комитетом РНИМУ им. Н.И. Пирогова (протокол №139 от 10 ноября 2014 г.).
Письменное информированное согласие на публикацию было получено от всех участвовавших пациентов и их семей.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.