Введение
По всему миру не менее 300 млн человек страдают от депрессии, которая является главной причиной нетрудоспособности и общего ухудшения качества жизни населения, опережая тревожность и расстройства, вызванные злоупотреблением алкоголем [1, 2].
В течение последних нескольких десятилетий стало понятно, что хронический стресс является значимым фактором риска в возникновении депрессии [3]. В ходе ряда исследований было установлено, что дофамин(ДА)ергическая система мозга и ее пути, отвечающие за процессы мотивации, эмоциональные реакции, продуцирования чувств удовольствия, ощущения награды и желания [4], могут принимать участие в реакции на хронический стресс, и, соответственно — в процессах формирования и течения депрессивных эпизодов [5, 6]. Однако точные молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе этих наблюдений, остаются до конца не выясненными.
Одним из подходов к изучению этих механизмов является моделирование депрессивно-подобного фенотипа, обусловленного стрессовыми факторами, у животных. Известно, что хронический стресс-фактор может быть реализован в виде прямого воздействия определенных фармакологических веществ на организм животного, и подобные модели успешно применяются в доклинических экспериментах [7, 8]. В связи с этим мы предположили, что длительное введение галоперидола, селективного блокатора дофаминовых D2-подобных рецепторов способно привести к возникновению депрессивно-подобного поведения. Предварительные данные, подтверждающие эту гипотезу, уже были получены ранее [9], в том числе и в нашей лаборатории [10], поэтому следующим шагом мы предприняли исследование молекулярно-генетических механизмов данного явления у крыс с депрессивно-подобным фенотипом, вызванным хроническим введением галоперидола.
Таким образом, в настоящей работе была поставлена цель изучить изменение экспрессии как гена Drd2, так и Drd2-зависимых генов (Bdnf, Ntrk2, Slc6a3, Pdyn и Per2) в префронтальной коре (ПФК), гиппокампе (ГП) и черной субстанции (ЧС) мозга крыс с хронической блокадой D2-рецепторов галоперидолом, используя ее как потенциальную фармакологическую модель депрессии. Это позволит понять роль изучаемых генов в формировании депрессивно-подобного поведения и, возможно, выявить новые молекулярно-генетические факторы, связанные с развитием клинической депрессии.
Материал и методы
Животные. Исследование проведено на 45 крысах-самцах линии Вистар (ФГУП «ПЛЖ "Рапполово"») возрастом 5—6 мес. Животные содержались в стандартных условиях вивария со сменой освещенности 12/12 и свободным доступом к воде и пище в соответствии с принципами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1985). Эксперименты на животных проведены в соответствии с положениями Хельсинкской Декларации 1975 г., пересмотренной и дополненной в 2008 г. директивами Национальных Комитетов по этике научных исследований. Работа была одобрена Этическим комитетом ИМГ РАН.
Дизайн эксперимента. Все вещества, используемые в исследовании, вводились внутрибрюшинно в общем объеме 0,2 мл/животное, в течение 24 дней.
Все крысы были разделены на три равные группы (n=15 в каждой):
1. Экспериментальная группа, которой ежедневно вводился селективный блокатор D2-рецепторов галоперидол («Галоперидол», Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко, Россия) в дозе 2,5 мг/кг (3 дня предварительного введения для достижения уровня не менее 90% заблокированных рецепторов).
2. Контрольная группа, которой ежедневно вводился физраствор.
С 4-го дня в экспериментальной и контрольной группах животных проводили оценку депрессивно-подобного поведения в динамике с помощью укороченной процедуры теста вынужденного плавания (ТВП), спустя 30 мин после введения галоперидола и физраствора, соответственно.
3. Интактная группа, которой ежедневно вводился физраствор, но ТВП не проводился.
Для того чтобы оценить не только эффект блокады D2-рецепторов, но и определить влияние модифицированного ТВП как такового на поведение животных, в эксперимент были введены одновременно и интактная, и контрольная группа.
На 3, 10 и 21-й день до ТВП проводили тест на предпочтение сахарозы (ТПС) для оценки уровня ангедонии у крыс. После ТВП в эти дни проводили выведение из эксперимента 5 животных из каждой группы для получения тканей мозга с последующим анализом относительной экспрессии выбранных генов.
ТВП. Установка данного теста представляла собой прозрачные цилиндры из оргстекла высотой 45 см и диаметром 20 см (ООО НПК «Открытая Наука», Россия) в количестве трех штук, отделенных друг от друга непрозрачной перегородкой. Цилиндры заполняли на 2/3 водой температурой +22±1 C. Длительность тестирования — 3 мин (укороченная процедура) [11]. Воду в цилиндре меняли не реже, чем после каждой третьей крысы (болюсы из воды удаляли после каждого животного).
Поведение животных регистрировали на камеру, и позже было посчитано время иммобильности — полного отсутствия плавательных движений передними и задними лапами, либо незначительные движения, необходимые только лишь для удержания головы над водой.
ТПС. Во время тестирования животных помещали на 1 ч в индивидуальные клетки (30´23´20 см, ООО НПК «Открытая Наука», Россия), где им предоставляли на выбор 2 поилки, в одной из которых находилась обычная вода, в другой — 2% водный раствор сахарозы [12]. Крысы были приучены к индивидуальным клеткам и 2% раствору сахарозы в течение 48 ч до начала эксперимента, чтобы избежать неофобии во время тестирования. Для предотвращения ложного предпочтения положение поилок изменяли ежедневно [13]. Животных дополнительно не подвергали предварительной процедуре пищевой или питьевой депривации.
Предпочтение сахарозы рассчитывали как процентное отношение количества выпитого раствора сахарозы к общему количеству потребляемой жидкости.
Получение тканей мозга. На 3, 10 и 21-й день, спустя 1,5 ч после ТВП, по 5 животных из каждой группы были выведены из эксперимента с помощью гильотины (ООО НПК «Открытая Наука», Россия). Головной мозг извлекали из черепной коробки и помещали на лед в течение 3 мин после декапитации. Для дальнейшего анализа из мозга были выделены три структуры: ПФК, ГП и ЧС, которые были законсервированы в растворе DNA/RNA Shield (Zymo Research Corp., USA) и транспортированы в сухом льде в лабораторию молекулярной генетики наследственных болезней Института молекулярной генетики Российской академии наук для последующего анализа относительной экспрессии выбранных генов.
Выделение тотальной РНК. Тотальная РНК (тРНК) была выделена с помощью Quick-RNA Miniprep Kit согласно рекомендациям производителя (Zymo Research Corp., США). Количество тотальной РНК определяли спектрофотометрически с применением набора Quant-iT RNA BR Assay Kit и флюориметра Qubit (Invitrogen, США).
Анализ относительной экспрессии генов. Одноцепочечную кДНК синтезировали трижды с каждого образца тРНК, используя набор ОТ-1 (Синтол) и 50 нг тРНК. Относительный уровень экспрессии гена определяли при помощи ПЦР в реальном времени, основанной на технологии TaqMan, и реактивов фирм «Синтол», «Евроген» и «ДНК-синтез». Были выбраны следующие гены интереса: Bdnf, Ntrk2, Slc6a3 (Dat), Drd2, Pdyn и Per2, и два гена сравнения Sars и Psmd6. Праймеры и зонды разрабатывали с помощью программного обеспечения Beacon Designer 7.02. В работе использовали последовательности, представленные в табл. 1. Реакции были проведены с помощью прибора для проведения ПЦР в реальном времени QuantStudio3 (Thermo Fisher Scientific Inc). В состав смеси для ПЦР входили: 0,2 мкл Taq-полимеразы (5 е.а./мкл); 3 мкл буферного раствора (´10); 3 мкл смеси дНТФ (по 25 нмоль/мкл каждого); 1.5 мкл MgCl2 (25 нмоль/мкл); 2 мкл раствора праймеров (по 10 пмоль каждого); 1 мкл раствора зондов (5 пмоль/мкл); 5 мкл раствора кДНК (0,02 нг/мкл); общий объем смеси доводили бидеионизованной водой до 30 мкл. Условия амплификации: 3 мин при 94 °C, затем 45 циклов по 10 с при 94 °C и 20 с при 60 °C. Все реакции повторяли троекратно для каждой кДНК. Значения пороговых уровней амплификации (Ct — threshold cycle) определяли с помощью программного обеспечения QuantStudio Design&Analysis Software 1.3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.). Данные по экспрессии гена Dat не были включены в последующий анализ, так как концентрация его транскрипта в исследуемых образцах оказалась ниже порога детекции прибора.
Таблица 1. Список праймеров и зондов
| Праймер/Зонд | Последовательность |
| Bdnf—F Bdnf—R Bdnf-p | 5’-GACAACAATGTGACTCCACTGC 5’-AACCGAAGTATGAAATAACCATAGTAAGG 5’-VIC-ATGGTCATCACTCTTCTCACCTGG-BHQ2 |
| Ntrk2—F Ntrk2—R Ntrk2-p | 5’-ACGTTGGGAATTTGGTTTCCAAAC 5’-TCTCCAACGAGGTTTTCTGCC 5’-VIC-AGATTTGTTTCCCACTGTCATCCGA-BHQ2 |
| Dat—F Dat—R Dat-p | 5’-GCCCATTTATGCGACCTACAAG 5’-CAGTGACGCAGCGTGAATTG 5’-VIC-CCCTCTGTCCACTAGCTGATGGTCTTTCTCAGGTGT-BHQ2 |
| Drd2—F Drd2—R Drd2-p | 5’-GCAGAAAGCTCTCCCAGCAG 5’-CAGTGTATATTCAGGATGTGCGTGATG 5’-VIC-GCTTGCCATTGTTCTCGGTGTGgttcatcat-BHQ2 |
| Pdyn—F Pdyn—R Pdyn-p | 5’-CAGTGAGGACGCAGGATGGG 5’-CAGAGGCAGTCAGGGTGAGAAA 5’-VIC-CCATCAACCCCCTGATTTGCTCCCTGG-BHQ2 |
| Per2—F Per2—R Per2-p | 5’-GATGGCCAACACAGACGACAATA 5’-CTCTGGCCCTCCGTGAAGTG 5’-VIC-ccagctgccctcccGGGATCTCCAG-BHQ2 |
| Psmd6—F Psmd6—R Psmd6-p | 5’-CTGGGAGAAAGTGAAATTCGAGATG 5’-GGCCACAGTCTTATCATATGTCTTG 5’-VIC-CCTCCTTGTCACCTATCTGACAGAGGTACTCTGCTT-BHQ2 |
| Sars—F Sars—R Sars-p | 5’-ACCCAGCCCTCATTCGAGAG 5’-TCAGCTTGTTCAAGTTGTCTGC 5’-VIC-CGTCGCCACTCGCTGTCTGCCTTCAC-BHQ2 |
Статистический анализ. Относительные количества транскриптов генов интереса в различных группах животных рассчитывали по формуле R=2^(–ddCt) согласно методу сравнения Ct [14]. При оценке эффекта блокады D2-рецепторов за единицу был принят уровень экспрессии генов интереса в контрольной группе, при определении влияния модифицированного ТВП, как такового, на поведение животных относительный уровень экспрессии генов интереса был принят за единицу в интактной группе. Данные анализировали с помощью непараметрического теста Манна—Уитни U. Все вычисления выполнены с применением программного обеспечения Statistica v8.0, а визуализацию данных производили в GraphPad Prism 8.
Результаты и обсуждение
ТВП. Оценка депрессивно-подобного поведения животных в динамике, проводившаяся с помощью ТВП, показала, что хроническая блокада D2-рецепторов галоперидолом оказала сильный значимый эффект (p=0,0043), проявляющийся в увеличении уровня иммобильности у крыс на 10-й и 21-й день эксперимента (рис. 1) по сравнению с контрольной группой, в которой время иммобильности не превышало медианное значение в 13 с (табл. 2).
Рис. 1. Изменение уровня иммобильности в ТВП на фоне блокады D2-рецепторов галоперидолом.
** — значимые отличия от контрольной группы при p<0,01; данные представлены как медиана и межквартильный диапазон (25—75 персентили).
Таблица 2. Результаты ТВП
| Группа | День эксперимента | |||
| фон | 3-й | 10-й | 21-й | |
| Контроль | 4,50 (2,0; 14,50) | 13,0 (5,0; 55,0) | 7,0 (3,5; 14,0) | 11,0 (5,0; 13,0) |
| Галоперидол | 11,0 (3,50; 33,0) | 63,0 (28,0; 123,0) | 118,0** (96,0; 131,0) | 115,0** (67,0; 142,0) |
Примечание. ** — значимые отличия от контрольной группы при p<0,01; данные представлены как медиана и 25—75 персентили.
ТПС. Оценка уровня ангедонии у крыс с помощью ТПС не выявила существенных различий между исследуемыми группами в ТПС на протяжении всего эксперимента (рис. 2, табл. 3). Лишь на 3-й день были значимы отличия между интактными и контрольными животными (p=0,0317).
Рис. 2. Динамика предпочтения сахарозы у исследуемых животных.
* — значимые отличия от интактной группы при p<0,05; данные представлены как медиана и межквартильный диапазон (25—75 персентили).
Таблица 3. Результаты ТПС
| Группа | День эксперимента | |||
| фон | 3-й | 10-й | 21-й | |
| Интактная | 94 (89; 98) | 86 (75; 92) | 92 (78; 97) | 69 (55; 89) |
| Контроль | 97 (90; 98) | 95* (91; 97) | 98 (93; 98) | 90 (70; 95) |
| Галоперидол | 94 (63;98) | 87 (79; 90) | 84 (78; 90) | 89 (47; 98) |
Примечание. * — значимые отличия от интактной группы при p<0,05; данные представлены как медиана и 25—75 персентили.
qRT-PCR. В ходе изучения относительных уровней экспрессии генов интереса было установлено, что наибольшее количество значимых различий между интактной и контрольной группами наблюдалось на 21-й день в ГП по таким генам, как Bdnf (p=0,0173), Ntrk2 (p=0,0303), Per2 (p=0,0087) и Pdyn (p=0,0043) и на 3-й день в ЧС по таким генам, как Ntrk2 (p=0,0079), Drd2 (p=0,0079) и Per2 (p=0,0159) (табл. 4).
Таблица 4. Результаты qRT-PCR (экспрессия мРНК относительно интактной группы)
| Контроль | |||||||||
| Ген | Префронтальная кора | Гиппокамп | Черная субстанция | ||||||
| 3-й | 10-й | 21-й | 3-й | 10-й | 21-й | 3-й | 10-й | 21-й | |
| Bdnf | 1,86 (1,58; 2,06) | 2,20 (1,00; 3,10) | 0,25 (0,22; 0,75) | 1,20 (0,98; 1,80) | 1,50** (1,40; 1,70) | 1,60* (1,40; 2,10) | 1,10 (0,61; 2,80) | 0,39 (0,25; 1,10) | 1,30 (1,00; 1,90) |
| Ntrk2 | 2,54** (2,16; 3,76) | 1,80 (1,80; 2,30) | 0,30* (0,24; 0,71) | 0,70 (0,67; 1,00) | 1,20 (1,10; 1,40) | 1,30* (1,30; 1,90) | 0,55* (0,48; 0,64) | 0,74 (0,54; 1,00) | 1,00 (0,95; 1,20) |
| Drd2 | 1,22 (0,88; 2,08) | 0,72 (0,39; 0,87) | 0,52 (0,20; 1,00) | 0,75 (0,62; 1,90) | 1,30 (0,74; 1,80) | 1,60 (1,40; 1,60) | 0,22** (0,18; 0,36) | 0,52 (0,26; 0,69) | 2,20 (0,59; 2,70) |
| Per2 | 1,25 (0,90; 1,47) | 1,10 (0,74; 1,50) | 0,76 (0,65; 0,85) | 1,10 (1,00; 1,40) | 1,20 (1,00; 1,60) | 1,80** (1,60; 2,60) | 0,62* (0,56; 0,77) | 0,69 (0,40; 1,10) | 0,71 (0,59; 1,00) |
| Pdyn | 1,01 (0,85;1,63) | 0,82 (0,59; 1,00) | 1,30 (1,10; 2,30) | 1,40 (1,10; 2,70) | 1,40* (1,20; 1,80) | 17,00** (10,00; 19,00) | 0,41 (0,29; 2,80) | 0,41 (0,26; 2,10) | 1,90 (1,40; 3,30) |
| Галоперидол | |||||||||
| Bdnf | 0,72 (0,21; 1,30) | 1,70 (0,36; 3,30) | 1,20 (0,69; 1,60) | 0,91 (0,84; 1,10) | 1,10 (1,00; 1,50) | 1,00 (0,39; 2,10) | 1,60 (0,71; 2,20) | 0,54 (0,34; 1,00) | 0,92 (0,54; 1,40) |
| Ntrk2 | 0,54 (0,35; 2,35) | 1,30 (0,28; 2,60) | 1,20 (1,00; 1,30) | 0,85 (0,72; 1,20) | 1,30 (1,10; 1,40) | 1,00 (0,56; 2,00) | 0,84 (0,51; 1,10) | 0,79 (0,71; 1,00) | 1,10 (0,86; 1,20) |
| Drd2 | 0,51 (0,38; 1,00) | 0,96 (0,61; 1,40) | 0,87 (0,68; 1,10) | 0,91 (0,57; 1,70) | 1,50 (0,82; 2,00) | 0,84 (0,71; 1,30) | 0,47 (0,27; 0,67) | 1,60 (1,00; 12,00) | 1,60 (0,85; 4,10) |
| Per2 | 0,66 (0,39; 0,88) | 1,10 (0,68; 1,90) | 0,84 (0,47; 1,30) | 1,20 (0,61; 3,10) | 1,00 (0,74; 1,30) | 1,90* (1,60; 2,40) | 0,76 (0,48; 1,60) | 1,10 (1,00; 1,50) | 0,83* (0,77; 0,89) |
| Pdyn | 0,78 (0,50; 0,98) | 0,96 (0,92; 1,00) | 1,40 (1,10; 1,60) | 0,87 (0,43; 1,50) | 0,92 (0,63; 1,20) | 10,00** (6,70; 24,00) | 0,30 (0,14; 2,80) | 1,10 (0,84; 3,40) | 1,50 (0,82; 3,20) |
Примечание. Данные представлены как медиана и 25—75%; значимые отличия от интактной группы (M — U test) выделены жирным шрифтом и отмечены как * — p<0,05, ** — p<0,01.
Следует отметить, что в контрольной группе в ГП и ЧС видна тенденция к увеличению относительной экспрессии генов интереса от 3-го к 21-му дню, в то время как в ПФК подобная закономерность имеет обратную направленность с падением экспрессии к 21-му дню.
На 21-й день в группе «галоперидол» по сравнению с интактной группой были выявлены значимые отличия относительных уровней транскриптов генов Per2 (p=0,0152) и Pdyn (p=0,0022) в ГП и гена Per2 (p=0,026) в ЧС.
При оценке различий между группами «галоперидол» и «контроль» значимые результаты были получены преимущественно в ПФК: на 3-й день по генам Bdnf (p=0,0303), Drd2 (p=0,0173) и Per2 (p=0,0173), а на 21-й день — по генам Bdnf (p=0,0303) и Ntrk2 (p=0,0173) (табл. 5).
Таблица 5. Результаты qRT-PCR (экспрессия мРНК относительно контрольной группы)
| Ген | Префронтальная кора | Гиппокамп | Черная субстанция | ||||||
| 3-й | 10-й | 21-й | 3-й | 10-й | 21-й | 3-й | 10-й | 21-й | |
| Галоперидол | |||||||||
| Bdnf | 0,40* (0,12; 0,72) | 0,91 (0,20; 1,80) | 3,60* (2,00; 4,60) | 0,71 (0,65; 0,83) | 0,76 (0,66; 1,00) | 0,60 (0,23; 1,30) | 1,30 (0,59; 1,80) | 1,10 (0,69; 2,10) | 0,69 (0,4; 1,00) |
| Ntrk2 | 0,19 (0,13; 0,84) | 0,66 (0,15; 1,30) | 3,30* (2,80; 3,70) | 1,10 (0,90; 1,40) | 1,10 (0,88; 1,10) | 0,67 (0,37; 1,30) | 1,50 (0,93; 2,00) | 1,00 (0,95; 1,30) | 1,10 (0,83; 1,10) |
| Drd2 | 0,26* (0,19; 0,51) | 1,60 (1,00; 2,30) | 2,00 (1,60; 2,60) | 0,92 (0,58; 1,70) | 1,30 (0,71; 1,70) | 0,54 (0,46; 0,82) | 1,90 (1,10; 2,80) | 3,20 (1,70; 4,30) | 1,10 (0,61; 2,90) |
| Per2 | 0,56* (0,33; 0,75) | 1,10 (0,67; 1,90) | 1,10 (0,64; 1,70) | 1,10 (0,54; 2,70) | 0,81 (0,58; 1,10) | 1,00 (0,79; 1,20) | 1,20 (0,73; 2,50) | 1,80 (1,60; 2,40) | 1,10 (1,00; 1,20) |
| Pdyn | 0,69 (0,44; 0,87) | 1,30 (1,20; 1,30) | 0,94 (0,77; 1,10) | 0,55 (0,27; 0,94) | 0,62** (0,43; 0,79) | 0,72 (0,46; 1,70) | 0,39 (0,18; 3,60) | 2,00 (1,50; 6,00) | 0,73 (0,39; 1,50) |
Примечание. Данные представлены как медиана и 25—75%; значимые отличия от контрольной группы (M — U test) выделены жирным шрифтом и отмечены как * — p<0,05, ** — p<0,01.
Известно, что хронические стрессоры способны вызывать депрессивно-подобные состояния у лабораторных животных. В ходе подобных исследований ТВП, уже доказавший свою эффективность в качестве средства поиска антидепрессантов [15], также успешно применяется для оценки депрессивного поведения как такового с фундаментальной точки зрения [16], где увеличение времени иммобильности рассматривается в качестве продепрессантного эффекта. В исследовании S. Dal-Zotto и соавт. установлено, что стресс, сообщаемый хроническим плаванием (14 дней по 20 мин) в установке, разработанной Р.Д. Порсолтом, не является сильным и животные к нему хорошо адаптируются [17]. Принимая во внимание то обстоятельство, что мы используем данную методику в значительно более мягкой модификации (21 день по 3 мин), считаем уровень стресса в этой процедуре несущественно влияющим на эмоциональное состояние животных, что также подтверждает стабильно низкий уровень иммобильности в контрольной группе (см. рис. 1), и уровень предпочтения сахарозы, не опускающийся ниже медианного значения в 90% (см. табл. 3).
При анализе полученных нами данных по изменению относительной экспрессии генов интереса становится очевидным, что в контрольной группе ТВП вызывает увеличение уровней транскриптов генов интереса в ГП на 10-й и 21-й день эксперимента (см. табл. 4). Мы предполагаем, что такой эффект обусловлен работой компенсаторных механизмов по преодолению воздействия мягкого хронического стресса, формируемого ТВП, отражающихся в отсутствии значимой эмоциональной реакции у животных. Этот вывод согласуется с данными других исследований, в которых ранее было показано, что более мягкие стрессоры вызывали повышение экспрессии генов Bdnf и Ntrk2 в ГП [18], более того, в некоторых случаях это был именно однократный или хронический ТВП [19]. В то же время различные хронические предсказуемые стрессоры приводят к снижению экспрессии Bdnf в ГП [20] и ПФК [21]. В целом же, если учитывать результаты не только предсказуемого стресса, известно, что снижение экспрессии генов Bdnf [7, 8], Ntrk2 [22] и Per2 [23] в ПФК и/или ГП, и/или ЧС — это негативный эффект, связанный с сильным хроническим стрессом, депрессией или действием токсинов. Существуют также некоторые свидетельства снижения экспрессии генов Drd2 и Pdyn при воздействии негативных факторов [24]. Таким образом, мы можем заключить, что снижение экспрессии генов Ntrk2, Drd2 и Per2 в ЧС у животных из контрольной группы на 3-й день эксперимента, предположительно, означает быстрый ответ и большую чувствительность этой структуры к стрессу и временную активацию адаптационных механизмов, которые восстанавливаются до нормального уровня к 21-му дню. В ПФК, напротив, динамика обратная — по-видимому, активация адаптационных механизмов в этом отделе мозга связана с увеличением экспрессии Ntrk2, гена рецептора к BDNF.
Блокада D2-рецепторов галоперидолом возвращает экспрессию большинства генов до уровня, не отличимого от интактной группы, что может свидетельствовать о негативном эффекте, нарушающем нормальные механизмы адаптации к стрессу в ГП и ЧС (см. табл. 4). Известно, что галоперидол снижает уровень Bdnf в ГП [25] и различных участках коры больших полушарий [26], а также снижает количество TrkB рецепторов в ГП [27]. Подобные эффекты мы наблюдали и в нашем эксперименте: галоперидол приводил к снижению экспрессии Bdnf, Drd2 и Per2 в ПФК на 3-й день, а также — Pdyn на 10-й день в ГП (см. табл. 5) по сравнению с контрольной группой. Увеличение относительной экспрессии Bdnf и Ntrk2 в ПФК на 21-й день может быть рассмотрено как следствие работы компенсаторных механизмов.
Кроме того, стоит отметить, что относительная экспрессия Per2 в ГП при блокаде D2-рецепторов не изменяется, а в ЧС — имеет однонаправленный характер с данными в контрольной группе. Значит мы можем предположить, что в нашем эксперименте Per2 не играет важной роли в регуляции реакции организма на стресс и при развитии депрессивно-подобного фенотипа напрямую, и его экспрессия в ГП и ЧС не зависит от Drd2, а, вероятно, опосредуется другими механизмами. Одним из кандидатов на эту роль является моноаминоксидаза A — известно, что ее активность регулируется часовыми генами, в том числе и Per2, а сам фермент принимает участие в работе ДАэргической системы и процессах, связанных с обеспечением эмоционального состояния организма [28].
В результате различных исследований также было показано, что хроническое введение галоперидола вызывает ангедонию [9]. Несмотря на то что в текущем эксперименте данные ТПС не указывают на наличие ангедонии у животных, результаты, ранее полученные в нашей лаборатории, показали вызванное галоперидолом (2,5 мг/кг) подавление гедонистического поведения в ТПС у крыс: 7-й день — 79,36±9,71%, 14-й день — 62,42±15,84%, 21-й день — 50,27±14,5%. Таким образом, хроническая блокада D2-рецепторов приводит к формированию депрессивно-подобного поведения, по-видимому, опосредованного снижением активности адаптационных механизмов, связанных с относительным угнетением экспрессии Bdnf, Ntrk2, Drd2 и Pdyn. Участие Pdyn в процессах формирования и протекания депрессии слабо изучено, хотя и установлена их роль в регуляции эмоциональных реакций организма [29]. Опираясь на известные данные о принципах функционирования системы вознаграждения в мозге [30], мы предполагаем, что блокирование D2-рецепторов, по-видимому, может влиять на экспрессию продинорфина, однако точный механизм остается невыясненным.
Заключение
В ходе данной работы было показано, что, по-видимому, в условиях нашего эксперимента галоперидол в некоторой степени угнетает относительную экспрессию изученных генов, приводя к снижению активности механизмов адаптации к стрессу в ДАергической системе мозга и развитию депрессивно-подобного фенотипа.
Все исследуемые гены принимали участие в связанном с депрессией стресс-ответе, однако, Bdnf и Ntrk2, по-видимому, играли наиболее важную роль. Кроме того, нами также было показано, что даже незначительный хронический стресс в укороченном ТВП, не отражающийся на поведении животных, влияет на экспрессию выбранных нами генов интереса.
Таким образом, можно заключить, что хроническая блокада D2-рецепторов галоперидолом приводит к формированию депрессивно-подобного фенотипа у крыс, влияет на экспрессию генов, вовлеченных в развитие депрессии, и может быть использована как фармакологическая модель депрессии.
Соблюдение этических стандартов.
Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №19-315-50014/19). Работа была выполнена: на базе ЦКП «Экспериментальная физиология и биофизика» ФГАОУ ВО «Крымского федерального университета им. В. И. Вернадского» и «Лаборатории молекулярной генетики наследственных заболеваний» ФГБУ «Института молекулярной генетики Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"».