Введение
Болезнь Паркинсона (БП) является одним из распространенных заболеваний нервной системы, которое поражает около 2—3% людей старше 65 лет. Развитие БП обусловлено гибелью различных типов нейронов. Главным образом происходит дегенерация дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции, что приводит к появлению двигательных симптомов. Именно по наличию ряда двигательных симптомов, таких как брадикинезия, ригидность и тремор покоя, ставят клинический диагноз данного заболевания [1]. Однако дегенерация дофаминергических нейронов в черной субстанции развивается в течение многих лет, задолго до появления клинических симптомов. Заболевание проявляется только после дегенерации около 70% дофаминергических нейронов [2]. В связи с проблемой длительного скрытого периода нейродегенерации необходим поиск прогностических биомаркеров развития БП.
В настоящее время доказано, что при БП происходят выраженные изменения на уровне транскриптома [3]. Были проведены работы как по изучению транскриптома в целом, так и по анализу изменения экспрессии отдельных генов. В большей части таких работ исследовали постмортальный материал мозга пациентов с БП, находящихся на последних и самых тяжелых стадиях заболевания и получавших активное медикаментозное лечение [4, 5]. По причине невозможности исследования тканей мозга пациентов на ранних стадиях БП основным подходом служит изучение изменений экспрессии генов в периферической крови [6]. Периферическая кровь является наиболее доступным материалом для исследования. Установлено, что в клетках крови экспрессируются тирозингидроксилаза [7] и рецепторы (D1- и D2-подобные рецепторы) дофамина [8]. Наличие данных белков характерно в первую очередь для дофаминергических нейронов. Также имеются данные, что изменения экспрессии отдельных генов могут быть сходны в черной субстанции и периферической крови мышей с МФТП-индуцированной моделью БП (МФТП — сокр. от 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) [9]. Все это позволяет предполагать, что уровни мРНК в периферической крови могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания.
Выявление ключевых генов заболевания и изучение функций кодируемых ими белков дает возможность понять, какие процессы могут быть вовлечены в патогенез БП. Проведенные в этом направлении работы позволили доказать причастность к гибели дофаминергических нейронов таких механизмов, как убиквитин-зависимая протеасомная деградация белков, митохондриальная дисфункция, нарушения дифференцировки дофаминергических нейронов и обмена дофамина, стресс эндоплазматического ретикулума, нарушение аутофагии и работы иммунной системы [2, 10]. Кроме того, к настоящему времени появились данные о том, что важную роль в патогенезе БП могут играть нарушения мембранного транспорта [11, 12]. В связи с этим в данной работе был проведен анализ изменения экспрессии генов DNM2, EPN2, и EXOC4 на уровне мРНК в периферической крови пациентов с ранней симптомной стадией (РСС) БП, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению. Продукты перечисленных генов участвуют в мембранном транспорте. Исследуемые гены были отобраны на основе ранее проведенных нами работ [9, 13] и данных литературы. Ген DNM2 был отобран в результате полнотранскриптомного анализа периферической крови пациентов с БП [13]. Гены EPN2 и EXOC4 выбраны в результате анализа полнотранскриптомных данных, а также анализа экспрессии этих генов в тканях мозга и периферической крови мышей с МФТП-индуцированными моделями поздней досимптомной стадии (ПДСС) и РСС БП [9].
Методы
Пациенты
Были исследованы 2 группы пациентов с диагнозом БП и 2 группы сравнения: неврологический контроль и здоровые добровольцы. Подробная информация представлена в работе, выполненной ранее [14].
Выделение РНК из крови и экспрессионный анализ
Выделение тотальной РНК из периферической крови, а также анализ уровней мРНК с применением методов обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (технология TaqMan) проводили в соответствии с протоколами, описанными ранее [14].
Статистический и биоинформатический анализ
Подбор ген-специфических последовательностей праймеров и TaqMan зондов, статистический и биоинформатический анализ проводили, как было описано ранее [15]. Полученные последовательности праймеров и TaqMan зондов приведены в табл. 1.
Таблица 1. Последовательности ген-специфичных праймеров и зондов
| Ген | Нуклеотидные последовательности систем праймеров и зондов TaqMan |
| POLR2F NM_021974.3* | Зонд: 5’-FAM-cttcatcctcctccacatcatcaaagtcgtcg-BHQ1-3’ Прямой праймер: 5’-atgtcagacaacgaggacaattttg-3’ Обратный праймер: 5’-tcttcggcattctccaagtcatc-3’ |
| PSMA5 NM_001199772.1 | Зонд: 5’-FAM-agccatcaagtcttcactcatcatcctc-BHQ1-3’ Прямой праймер: 5’-agaagtttaccacaagtctatgac-3’ Обратный праймер: 5’-cattcagcttctcctccattac-3’ |
| DNM2 NM_001005360.2 | Зонд: 5’- VIC-ttggagaacaagttgctccc-BHQ2-3’ Прямой праймер: 5’-tcaccaagcttgacctgatg-3’ Обратный праймер: 5’- cgccaatgtagcctcttctc-3’ |
| EPN2 NM_014964.4 | Зонд: 5’-ROX-agccgaatctgtgacctctctgccatcc-BHQ2-3’ Прямой праймер: 5’-ctgaatttgacaaccttcggacttc-3’ Обратный праймер:5’-gggtcagggctggtagttcc-3’ |
| EXOC4 NM_021807.4 | Зонд: 5’-ROX-tcaatccacagtttccgaagctcatcccgt-BHQ2-3’ Прямой праймер: 5’-tcactaactcccgaaataaaataaagc-3’ Обратный праймер: 5’-acaagttcaggacatgcttatgc-3’ |
Примечание. * — инвентарные номера (Accession numbers) в базе данных GenBank (NCBI-GenBank Release 229.0). FAM, VIC, ROX — флюоресцентные красители, BHQ1и BHQ2 — тушители флюоресценции. Курсивом выделены праймеры, использованные для проведения реакции обратной транскрипции.
Результаты и обсуждение
В данной работе был проведен анализ экспрессии генов DNM2, EPN2 и EXOC4 в периферической крови у пациентов с БП, как подвергавшихся, так и не подвергавшихся лечению, а также в контрольных выборках (неврологический контроль, здоровые испытуемые). С использованием ресурса Pathway Studio (версия 12.4.0.3, Elsevier) была построена функциональная сеть для исследуемых генов (см. рисунок). Как видно на рисунке, прямых связей исследуемых генов с БП на основе базы данных статей данного ресурса не выявлено. В то же время построенная сеть демонстрирует вовлеченность изучаемых генов в процессы мембранного транспорта. В настоящее время установлено, что процессы мембранного транспорта могут играть важную роль в патогенезе БП [11, 12]. Это позволяет предположить, что гены DNM2, EPN2 и EXOC4 являются потенциальными генами-кандидатами БП.
Функциональная сеть для исследуемых генов. Сеть была построена с использованием программы Pathway Studio (версия 12.4.0.3, Elsevier).
Прямоугольниками обозначены клеточные процессы, эллипсами — исследуемые гены, стрелками — регуляторные взаимодействия.
Результаты проведенного экспрессионного анализа представлены в табл. 2: статистически значимые изменения экспрессии на уровне мРНК относительно контроля были получены только для гена DNM2 в выборке пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Для группы пациентов с БП, не подвергавшихся лечению, а также для неврологического контроля характерно отсутствие достоверных изменений.
Таблица 2. Изменение уровней мРНК исследуемых генов
| Ген | Пациенты с БП, подвергавшиеся лечению | Пациенты с БП, не подвергавшиеся лечению | Неврологический контроль |
| DNM2 | 0,291 | 0,89 | 0,81 |
| 0,26—0,582 | 0,48—1,29 | 0,39—1,18 | |
| EPN2 | 0,65 | 0,93 | 0,65 |
| 0,29—1,33 | 0,49—1,19 | 0,34—1,05 | |
| EXOC4 | 0,93 | 0,67 | 0,77 |
| 0,72—1,17 | 0,35—2,33 | 0,67—1,02 |
Примечание. 1 — медиана, 2 — 25—75 процентили. Значения с p<0,05 выделены жирным шрифтом. Уровень экспрессии в контроле принят за единицу.
Ген EPN2 кодирует белок, принимающий участие в клатрин-зависимом эндоцитозе. Данный ген обильно экспрессируется в головном мозге. Его продукт локализуется вблизи комплекса Гольджи во фракции везикул, покрытых клатрином [16]. В литературе нет данных о причастности данного гена к БП и процессам нейродегенерации. Продукт гена EXOC4 — белок SEC8 является компонентом комплекса экзоцисты, функция которого связана с транспортом везикул, а именно с их направлением и стыковкой в определенных местах на плазматической мембране. Кроме того, компоненты комплекса участвуют в ремоделировании цитоскелета [17]. В нейронах экзоциста необходима для ветвления нейритов и синаптогенеза, но не для высвобождения синаптических пузырьков в зрелых синапсах [18]. Было показано, что SEC8 участвует в доставке NDMA- и AMPA-ионотропных глутаматных рецепторов на поверхность клетки [19, 20]. Имеются данные о вовлеченности NDMA- и AMPA-рецепторов в развитие леводопа-индуцированной дискинезии у животных с моделью БП [21, 22], а также об их потенциальном терапевтическом значении для облегчения дискинезии у пациентов [23, 24]. Хотя в более ранней работе для генов EPN2 и EXOC4 были продемонстрированы изменения экспрессии в тканях мозга и периферической крови мышей с МФТП-индуцированными моделями БП [9], в настоящей работе не было выявлено достоверных изменений экспрессии в периферической крови пациентов с РСС БП. Полученные данные могут указывать на то, что эти гены не играют существенной роли в патогенезе ранней стадии БП, либо изменения их экспрессии в периферической крови у человека не отражают изменения, происходящие в мозге. В связи с вышесказанным гены EPN2 и EXOC4 не могут служить биомаркерами БП.
Ген DNM2 экспрессируется повсеместно и играет важную роль в клатрин-зависимом эндоцитозе и динамике цитоскелета. Он кодирует белок динамин-2, который является ГТФазой, отвечающей за расщепление везикул. Мутации в гене DNM2 были ассоциированы с 2 аутосомно-доминантными заболеваниями — аксональной формой болезни Шарко—Мари—Тута и центроядерной миопатией [25, 26]. Было показано, что с семейством белков динаминов, в частности с динамином-2, взаимодействует белок, кодируемый геном LRRK2. Мутации в гене LRRK2 ассоциированы с аутосомно-доминантной формой БП [27]. Из табл. 2 видно, что экспрессия DNM2 снизилась в 3,5 раза в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся лечению. В группах неврологического контроля и пациентов, не подвергавшихся лечению, не было достоверных изменений уровня мРНК DNM2 относительно группы здорового контроля. Данный результат может говорить о том, что этот ген не играет важной роли в патогенезе БП на ранних стадиях, однако на его экспрессию оказывает влияние прием агонистов дофамина. В настоящее время имеются данные об усилении интернализации дофаминергических рецепторов в ответ на введение агонистов дофамина, в результате чего происходит снижение количества функциональных рецепторов на поверхности клетки [28, 29]. В одной из работ N. Kabbani и соавт. показали, что процесс интернализации дофаминергических D2-рецепторов в ответ на введение агонистов дофамина, по-видимому, опосредован динамином-2 [30]. В нашей работе мы наблюдали снижение экспрессии DNM2 у пациентов с ранней стадией БП, подвергавшихся лечению агонистами дофамина, что может указывать на усиление компенсаторных механизмов, связанных со снижением интернализации дофаминергических рецепторов в результате уменьшения уровня динамина-2.
Заключение
Результаты настоящей работы позволяют предположить, что гены DNM2, EPN2 и EXOC4 не вовлечены в патогенез заболевания на уровне мРНК у пациентов с ранней стадией БП и не могут быть рассмотрены в качестве прогностических биомаркеров БП. Изменение экспрессии гена DNM2 у пациентов с БП, подвергавшихся лечению, может свидетельствовать о том, что данный ген вовлечен в процессы, подверженные воздействию терапии агонистами дофамина. Таким образом, анализ изменения экспрессии гена DNM2 может быть полезным при исследовании патологий, спровоцированных длительным приемом агонистов дофамина.
Финансирование. Работа была выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект №20-15-00262). Были использованы приборы Центра коллективного пользования НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.