Введение

Во всем мире ежегодно возрастает заболеваемость меланомой, по аналитическим данным, прогнозируемый ежегодный прирост новых случаев заболевания составляет более 87 тыс. [1]. При этом в последнее десятилетие наблюдается положительная динамика по увеличению средней выживаемости пациентов больных меланомой — в 2011 г. данный показатель составлял 9 мес, в 2018 г. прогнозируемый показатель — 2 года [2]. Данное явление в значительной степени обусловлено введением в клиническую практику средств иммунотерапии [3]: с 2011 г. FDA и EMA одобрили новые препараты для лечения меланомы, в том числе антитела против CTLA-4 ipilimumab (Yervoy), антитела против PD-1 nivolumab (Opdivo), пембролизумаб (Keytruda), онколитический генетически модифицированный вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) Talimogenelaherparepvec (T-VEC, Imlygic), онколитический рекомбинантный вирус осповакцины (OncoVex), что стало большим достижением в области терапии злокачественных новообразований при меланоме.

Среди активно развивающихся методов иммунотерапии выделяют онколитическую иммунотерапию, заключающуюся в применении вирусов, обладающих естественным тропизмом к неопластическим клеткам, либо с генетическими модификациями, приводящими к повышению антиканцерогенных свойств самого вируса и регуляции иммунной системы пациента [4]. Опухолевые клетки не имеют мощного противовирусного ответа, что делает их чувствительными к вирусной инфекции, которая приводит к регрессии опухоли через 2 разных механизма: лизис опухолевых клеток и стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа [5].

Была показана эффективность онколитических вирусов не только в качестве литического агента, но и в качестве мощного стимулятора противоопухолевых процессов, опосредованных иммунной системой [6]. Онколитический реовирус способен устранять метастазы в лимфатическом узле и селезенке. На примере линии клеток мышиной меланомы B16Ova показано, что именно иммунные ответы, вызванные вирусом, а не опосредованный вирусом онколиз, имеют решающее значение для противоопухолевой эффективности реовируса. Также обнаружено, что локальное введение онколитического вируса болезни Ньюкасла у иммунокомпетентных мышей может значительно замедлить рост опухолей.

Важно отметить, что в некоторых случаях введение инактивированного вируса приводит к регрессии опухолей в иммунокомпетентных моделях животных, подчеркивая влияние иммунной системы на опосредованный вирусом противоопухолевый эффект [7, 8]. Поэтому онколитические вирусы рассматриваются не только в качестве агента, лизирующего опухолевые клетки, но и в качестве иммуномодулирующего препарата, либо способа доставки иммунотерапевтических молекул.

Цель исследования — получение онколитического вируса на основе вируса осповакцины (ВОВ) штамм L-IVP, в геном которого дополнительно введены гены, кодирующие гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и искусственный полиэпитопный иммуноген, а также изучение свойств полученного вируса in vitro и in vivo.

Материал и методы

Штамм Л-ИВП ВОВ получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Эукариотические культуры клеток 4647 и CV-1 получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Культуры клеток SW 620, A 431, OVCAR-3, C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 получены из коллекции Института цитологии и генетики СО РАН.

Предсказание эпитопов проводили на сервере IEDB с использованием метода ANN.

Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ проводили в соответствии со стандартным протоколом [9]. Осуществляли электроперенос исследуемых белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью прибора фирмы «Bio-Rad» (США). Центры неспецифического связывания блокировали инкубацией нитроцеллюлозной мембраны в растворе 0,5% бычьего сывороточного альбумина в PBST-буфере. В качестве первичных антител использовали иммунную сыворотку, полученную иммунизацией кроликов целевыми рекомбинантными белками, полученными в прокариотической системе экспрессии E. coli (GM-CSF, полиэпитопный иммуноген). Конъюгат пероксидазы хрена с антикроличьим иммуноглобулином козы (BioRad, США) использовали в разведении 1:5000. Детекцию иммунных комплексов проводили окрашиванием свежеприготовленным раствором 4-хлор-1-нафтол («Aldrich», США) в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 4,7 с концентрацией 500 мкг/мл, содержащем 0,0015% перекиси водорода.

МТТ-тест. Сравнительное изучение цитолитических свойств вариантов ВОВ проводили, используя МТТ-тест. 50% монослой клеток заражали изучаемыми вирусами с множественностью заражения 0,001 БОЕ/кл, 0,01 БОЕ/кл, 0,1 БОЕ/кл, 1 БОЕ/кл, 10 БОЕ/кл. Через 72 ч добавляли 5 мг/мл МТТ (Sigma, США), и инкубировали 4 ч при 37 °С, после чего добавляли 200 мкл диметилсульфоксида и инкубировали в течение 1 ч. Затем измеряли оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 540 нм на приборе Multiskan FC (Thermo Scientific, США) и определяли дозы исследуемых вирусов, при которых жизнеспособными остаются 50% клеток (ЦПД₅₀).

Оценка ростовых свойств L-IVP _oncoM. Для изучения динамики роста L-IVP_oncoM 90% монослой клеток линий 4647 и CV-1, полученный на 6-луночных планшетах, инфицировали с множественностью заражения 1 БОЕ/клетка в трех повторах с инкубацией 0, 24, 48, 72 ч при 37 °С в условиях 5% CO₂. После трехкратного замораживания-оттаивания содержащие вирус препараты титровали методом бляшек в монослое клеток CV-1. Помимо линии клеток CV-1 использовали линию 4647, которая аттестована для производства иммунобиологических препаратов.

Изучение онколитических свойств L-IVP_oncoM in vivo. Для получения солидных подкожных опухолей суспензию клеток SK-Mel-28 в количестве 1·10⁷ клетка/мышь (объем 100 мкл) вводили самкам линии SCID (всего 26 животных) подкожно в область правой лопатки и вычисляли объем опухоли (V) по формуле: V=(a×b²)/2, где a — наибольший диаметр опухоли, b — наименьший диаметр опухоли [10].

Для оценки онколитического эффекта L-IVP_oncoM по достижению объема опухоли 200 мм³ вводили вирусный материал интротуморально в дозе 1·10⁷ БОЕ/мышь в 100 мкл физиологического раствора («Биолот», Россия), в качестве контроля вводили 100 мкл физиологического раствора.

Сравнительную оценку изменения объема опухоли проводили каждые 3 сут от даты инъекции вирусного материала. Забой мышей в количестве 2 головы на точку проводили на 4, 8, 12, 16 и 32-е сутки после введения препаратов и производили забор органов (селезенка, печень, легкие, почки, яичники, кровь) для оценки распределения вируса по жизненно важным органам. На 47-е сутки выводили всех оставшихся животных из эксперимента.

Гистологические исследования проводили согласно протоколу [11].

Результаты и обсуждение

Получение рекомбинантного вируса L-IVP_oncoM. При помощи биоинформатического анализа была проведена оптимизация и конструирование полиэпитопного иммуногена, состоящего из эпитопов ОАА, для которых согласно литературным данным показан высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках при меланоме. На первом этапе работы была проведена оптимизация состава эпитопов полиэпитопного имуногена и подобраны спейсерные последовательности, обеспечивающие доставку целевой конструкции в клетки организма для последующей эффективной презентации иммунной системе.

Оптимизацию состава полиэпитопного иммуногена проводили при использовании данных, опубликованных в реферируемых журналах и базах данных. В ходе работы были выбраны аллельные варианты молекул MHC I класса HLA-A*0201 — как наиболее распространенные и изученные в человеческой популяции [12]. Были отобраны пептиды, для которых предсказанное значение pIC₅₀ (характеристика аффинности взаимодействия пептида с молекулой MHC) выше, чем 6,8. Согласно литературным данным значение IC₅₀<50 нM соответствует высокоэффективному связыванию, от 50 до 500 — низкоэффективному. Из-за клональной селекции для эпитопов с IC₅₀<50 нM отсутствуют распознающие их T-клетки, поэтому для каждого антигена было выбрано несколько эпитопов. Таким образом, в состав конструкции вошли эпитопы, принадлежащие к семействам: NY-ESO-1, MART-1, MADE-A1, MAGE-A3, MAGE-C1, gp-100, tyrosinasе, TRP-2, TRAG-3. Рассчитанная полиэпитопная конструкция для улучшения протеосомной деградации и дополнительной стимуляции цитотоксического ответа на все включенные в состав конструкции антигенные детерминанты на N-конце содержит убиквитин с замененной С-концевой аминокислотой (Gly76-Val) [13].В качестве спейсера на С-конце ЦТЛ-эпитопов расположен дипептид «AD» [14]. Для лучшего узнавания на С-конец конструкции добавлены универсальные Т-хэлперные эпитопы (p2, PADRE), которые отделены друг от друга спейсерным трипептидом «ARY».

Затем рестриктазно-лигазным методом получали плазмиду интеграции, содержащую последовательность ДНК, кодирующую искусственный иммуноген, гомологичные участки вирусного генома, в район которого запланирована целевая встройка, а также ген gpt, кодирующий ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу E. coli. Наличие гена gpt в составе плазмиды интеграции обеспечивает жизнеспособность рекомбинантных вариантов вируса при встройке плазмиды в состав вирусного генома на среде, содержащей микофеноловую кислоту.

Методом временно доминантной селекции [15]на основе полученного ранее вируса L-IVP_TK(-)_GM-CSF(+)_A34R(D110N_K151E) был получен онколитический ВОВ, содержащий в своем геноме ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов опухолевых антигенов, экспрессирующихся опухолевыми клетками при меланоме (L-IVP_oncoM).

Была подтверждена продукция полиэпитопного иммуногена и GM-CSF в составе вирусного генома при помощи вестерн-блот анализа (рис. 1).

Ростовые свойства L-IVP_oncoM. Проведенный эксперимент не выявил значимых различий в ростовых характеристиках исследуемого рекомбинантного L-IVP_oncoM в сравнении с исходным вариантом вируса в культуре клеток CV-1, 4647 (рис. 2).

Оценка цитолитической активности L-IVP_oncoM на раковых культурах клеток различного генеза. Выявлено, что линии клеток SW 620, A431, OVCAR-3, C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 чувствительны к исследуемым вариантам ВОВ (рис. 3).

ЦПД₅₀ исследуемых вариантов ВОВ в среднем варьирует в пределах 1—5 БОЕ/клетка, что соответствует значению ЦПД₅₀ для культуры клеток CV-1, которая является высокочувствительной к ВОВ.

Онколитическое действие L-IVP_oncoM. Оценку эффективности онколитического действия вируса оценивали в модели ксенографтов опухоли человека на иммунодефицитных мышах линии SCID, образованных клетками меланомы человека SK-Mel-28. Данная клеточная линия характеризуется высокой эффективностью формирования опухолевого узла и его активным ростом.

Полученные данные свидетельствуют о выраженном замедлении опухолевого роста у животных экспериментальной группы по сравнению с животными контрольной группы (рис. 4). Достоверные различия наблюдаются на 45-е сутки после введения препарата в опухолевый узел.

Для изучения изменений в опухолевом узле, вызванных L-IVP_oncoM, проводили гистологическое исследование (рис. 5). Опухолевый трансплантат SK-Mel-28 в контрольной группе характеризуется наличием тонкой капсулы, развитой сети новообразованных сосудов и небольших редких зон некрозов опухоли. Большая часть среза опухолевого узла представляет собой обширные поля гемо- и плазморрагии с включением клеток опухоли.

У животных обеих опытных групп в отношении некротических изменений опухолевой ткани морфологическая картина схожа. Исключение наблюдалось, начиная с 8-х суток после введения L-IVP_oncoМ, когда у исследованных животных обнаруживались очаги некроза опухолевой ткани (см. рис. 4, в, г).

Также среди клеточного детрита опухоли обнаружены структуры, морфологически схожие со структурами, возникающими на различных этапах морфогенеза вирусов семейства Orthopoxvirus (виросома) (см. рис. 4, а, б). В каждом случае исследовали около 200 профилей клеток. В основном репродукция наблюдалась в клетках SK-Mel-28, что свидетельствует об избирательной репликации исследуемого вируса в клетках опухоли. Также это подтверждают результаты титрования 10% гомогенатов опухолей, где по мере роста опухоли сохранялся титр вирусных частиц в пределах 10⁴—10⁵ БОЕ/мл на протяжении всего времени эксперимента.

Частота спонтанной регрессии метастатической меланомы, включающая полную и частичную клиническую ремиссию, составляет, по данным разных авторов, от 0,25 до 1,0% [16]. Клинические исследования свидетельствуют о корреляции регрессии меланомы и активации опухоль-специфичных CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, которые обнаруживают в периферической крови и метастазах. Их активация происходит за счет гиперэкспрессии ОАА на поверхности неопластических клеток. В этой связи в настоящее время появляется все больше исследований по изучению противоопухолевых препаратов, активирующих T-клеточный иммунный ответ.

В данной работе нами при помощи метода временной доминантной селекции был получен онколитический ВОВL-IVP_oncoM, содержащий в своем геноме ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов опухолевых антигенов, экспрессирующихся клетками меланомы. Рекомбинантный ВОВ L-IVP_oncoM был получен на основе ВОВ L-IVP_TK(-)_GM-CSF(+)_A34R(D110N_K151E) (неопубликованные данные), характеризующегося нарушенным геном, кодирующим тимидинкиназу, в район которого встроен ген, кодирующий GM-CSF. Кроме того, данный вирус характеризуется повышенной способностью образовывать внеклеточные оболочечные вирионы, за счет введенных нами ранее нуклеотидных замен в гене A34R, приводящих к аминокислотным заменам D110N и K151E в мембранном гликопротеине A34 [17].

Предположительный механизм действия данного вируса заключается в синергетическом эффекте онколитических и иммуностимулирующих свойств. Стратегия является уникальной: в настоящее время не существует ни одной кандидатной противоопухолевой терапии на основе онколитического вируса, экспрессирующего полиэпитопные конструкции. Использование искусственных полиэпитопных конструкций нацелено на стимуляцию высокого уровня иммунного ответа не только на доминантные, но и на субдоминантные эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА). Для лучшего представления опухоль-специфичных эпитопов иммунной системе и исправления цитокинового дисбаланса в микроокружении опухоли в состав ВОВ одновременно встроен ген, кодирующий GM-CSF. Для обеспечения более высокой эффективности репликации вируса в опухолевых клетках дополнительно инактивированы гены ВОВ, кодирующие тимидинкиназу и вирусный ростовой фактор. Селективность при этом будет обеспечиваться наличием в опухолевых клетках, в отличие от здоровых клеток организма, высоких уровней клеточной тимидинкиназы и различных ростовых факторов. Для эффективного распространения вируса по организму с целью усиления онколитического потенциала ВОВ относительно метастазов полученный вирус содержит ген, кодирующий гликопротеин A34 с двумя нуклеотидными заменами K151E и D110N. Данные замены увеличивают эффективность формирования внеклеточных оболочечных вирионов, которые способны обеспечить большую эффективность распространения вируса в межклеточном пространстве и по кровеносному руслу в целом, так как обладают низкой иммуногенностью.

Следует заметить, что в настоящее время является затруднительной проверка биологических эффектов, опосредованных экспрессией полиэпитопной конструкции в составе вирусного генома (в том числе GM-CSF) в экспериментальных моделях in vivo, так как дизайн конструкции производился исходя из последовательностей ОАА человека. Оценку индукции опухоль-ассоциированного иммунного ответа через стимуляцию CD4+ и CD8+ Т-клеток возможно будет осуществить только на стадии клинических исследований.

Подходы к онкотерапии, основывающиеся на использовании биологических эффектов GM-CSF и применении ДНК-вакцин, содержащих ОАА, активно развиваются, что свидетельствует о перспективности использования данных белков либо кодирующих их генов в составе вектора доставки, в случае данной работы — использование ВОВ.

Таким образом, на первом этапе работы по характеризации полученного вируса L-IVP_oncoM необходимо провести эксперименты in vitro, демонстрирующие биологические свойства вируса, для дальнейшей возможности проведения доклинических и клинических исследований.

Поскольку встройка целевой последовательности производилась в участок генома, ответственного за ростовые свойства вируса, это могло повлиять на репродукцию вируса на культурах клеток. Эксперимент по изучению ростовых свойств L-IVP_oncoM был проведен относительно исходного клонового варианта ВОВ, не содержащего встройки генов, кодирующих GM-CSF и полиэпитопный иммуноген.

В ходе эксперимента не выявлено достоверно значимых различий между ростовыми свойствами Л-ИВП_oncoM и L-IVP 5cl. Это свидетельствует о том, что проведенные модификации вирусного генома не повлияли на его репродукцию в эукариотических культурах клеток 4647 и CV-1, что позволит в дальнейшем использовать данные клетки для наработки рекомбинантного вируса.

Наличие продукции полиэпитопного иммуногена и GM-CSF в составе вирусного генома свидетельствует о способности данных белков продуцироваться в эукариотических клетках при попадании в них вирусного вектора, содержащего гены, кодирующие GM-CSF и полиэпитопный иммуноген.

Кроме того, при помощи МТТ-теста нами была изучена чувствительность раковых культур клеток SW 620, A431, OVCAR-3,C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 к полученному L-IVP_oncoM.

Выявлено, что линии клеток, используемые в эксперименте, чувствительны к исследуемым вариантам ВОВ, что свидетельствует о широком тропизме L-IVP_oncoM в отношении опухолевых клеток человека различного генеза. Данное свойство полученного вируса может оказать положительный эффект при терапии метастазирующих форм меланомы, чтов дальнейшем требует дополнительного изучения.

Ключевым требованием для улучшения результатов исследований препаратов против меланомы является применение моделей, повторяющих биологические и молекулярные характеристики заболевания человека. Формирование у иммунодефицитных мышей ксенотрансплантантов на основе культуры раковых клеток человека позволяет частично смоделировать состояние онкопатологии и оценить онколитический потенциал вируса [18].

Для формирования ксенотрансплантантов была выбрана культура клеток меланомы человека SK-Mel-28, которая обладает чувствительностью к изучаемому ВОВ, что было подтверждено результатами МТТ-теста.

Полученные данные in vivo свидетельствуют о выраженном замедлении опухолевого роста у животных экспериментальной группы по сравнению с животными контрольной группы, что подтверждают результаты гистологического исследования, где обнаружена продукция исследуемого вируса в опухолевых клетках, а также участки разрушения опухолевой ткани. Вероятно, некрозы в опухолевом узле вызваны не только действием вируса, но и нарушенной трофикой клеток вследствие активной пролиферации и недостаточной скорости роста кровеносных сосудов.

Полная редукция опухолевого узла не была достигнута, вероятно, вследствие активной пролиферации клеток SK-Mel-28 и однократной инъекции вируса. В дальнейшем необходимо провести эксперименты для подбора наиболее эффективной дозы препарата, количества инъекций, а также временных промежутков между инъекциями.

Заключение

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что, возможно, ключевую роль в механизме действия онколитических вирусов играет не вирус-опосредованный цитодеструктивный эффект, а именно иммуностимулирующий эффект. При заражении вирусом происходит изменение иммунного статуса организма, в том числе изменяется профиль продукции цитокинов, ростовых факторов и др., что может приводить к устранению опухоль-ассоциированной иммуносупрессии.

Полученные нами данные в экспериментах in vitro и in vivo свидетельствуют о перспективности использования вируса L-IVP_oncoM в качестве онколитического агента, иммуностимулирующие свойства которого будут исследованы в дальнейшем.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10101).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that they have no competing interests.

Соблюдение этических стандартов. Все применимые международные, национальные принципы ухода и использования животных были соблюдены.