Введение

Учитывая то, что иммунизация против натуральной оспы живым вирусом осповакцины (vaccinia virus, VACV) в ряде случаев приводила к тяжелым побочным реакциям, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) после заключения о глобальной ликвидации оспы в 1980 г. рекомендовала прекратить такую вакцинацию во всех странах [1]. Итогом этого решения явилось то, что за прошедшие годы большая часть человечества утратила иммунитет не только против натуральной оспы, но и против других зоонозных ортопоксвирусных инфекций человека [2]. Участившиеся в последние годы случаи инфицирования людей зоонозными ортопоксвирусами и, в первую очередь, вирусом оспы обезьян, заставляют с новой силой вернуться к рассмотрению вопроса о профилактике этих заболеваний [3].

Вирус оспы обезьян (monkeypox virus, MPXV) вызывает инфекцию человека, по клиническим признакам напоминающую дискретную форму оспы [1, 4]. Природным резервуаром MPXV являются различные виды африканских животных, в основном грызуны. При этом летальные случаи при заболевании людей оспой обезьян выявляли только в Центральной Африке [5]. В дальнейшем геномный анализ изолятов MPXV из разных регионов Африки позволил разделить этот вирус на два подтипа: центральноафриканский (CA-MPXV) и западноафриканский (WA-MPXV) [6, 7]. При экспериментальном инфицировании чувствительных животных было показано, что вариант CA-MPXV обладает большей патогенностью по сравнению с WA-MPXV [8—10].

Исследования последних лет указывали на увеличивающуюся эффективность распространения MPXV в человеческой популяции. Анализ имеющихся данных позволил заключить, что к 2010 г. (через 30 лет после прекращения противооспенной вакцинации) заболеваемость людей оспой обезьян в Демократической Республике Конго (Центральная Африка) возросла в 20 раз [11].

За период 2010—2018 гг., по данным ВОЗ, выявлено расширение ареала распространения оспы обезьян среди людей и животных в Центральноафриканской республике, Камеруне, Демократической Республике Конго, Либерии, Нигерии, Республике Конго и Сьера Леоне [12].

В последнее время особое внимание привлекла вспышка оспы обезьян среди людей в Нигерии [13, 14]. Секвенированием вирусной ДНК подтверждено, что данную вспышку заболевания обусловливал WA-MPXV. Важнейшим моментом этой вспышки оспы обезьян в Нигерии явилось то, что эта инфекция вышла за пределы Африки и оспа обезьян была выявлена у людей, выехавших из Нигерии в Израиль (сентябрь 2018 г.), Великобританию (сентябрь 2018 г., декабрь 2019 г., май 2021 г.), Сингапур (май 2019 г.) и США (июль и ноябрь 2021 г.) [15, 16].

После того как слабовирулентный WA-MPXV адаптировался к сообществу мужчин, практикующих секс с мужчинами, начался новый этап распространения и эволюции этого вируса. По завершении массового международного гей-парада на Гран-Канари в мае 2022 г. случаи оспы обезьян у людей стали регистрироваться во многих странах на разных континентах в этих группах населения [17, 18]. На 31 августа 2023 г. зарегистрировано более 89 тыс. подтвержденных случаев оспы обезьян у людей в 106 странах, где ранее это заболевание не выявлялось. Наибольшее распространение при этом оспа обезьян среди людей получила в США (более 30 тыс. случаев при 49 летальных исходах) [19].

Результатом такой распространенной эпидемии оспы обезьян среди людей может явиться ускоренная эволюция MPXV и появление вариантов вируса с большей эффективностью передачи от человека к человеку и с увеличенной патогенностью [2]. Поэтому контролю над этой эпидемией в настоящее время уделяется большое внимание.

Самым надежным способом защиты от любого вирусного заболевания является вакцинопрофилактика. Исторически первым примером такой защиты от инфекционного заболевания явилась иммунизация против оспы, используя живой VACV [3, 20].

Вакцины на основе VACV не имеют выраженной видоспецифичности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека, поэтому они могут быть применены при инфекционных вспышках, обусловленных любым видом ортопоксвирусов [1, 4].

Исторически первым способом противооспенной иммунизации явился метод инокуляции вакцины в скарифицированную кожу (с/к). Однако этот метод не обеспечивает точного дозирования вакцины и для успешного выполнения процедуры нужно использовать вакцину в высокой концентрации. Альтернативой с/к-методу может служить процедура внутрикожной (в/к) инъекции вакцины, особенно при использовании ее в низкой концентрации [21].

Целью данной работы явилось изучение влияния дозы и кратности иммунизации мышей линии BALB/c при в/к инъекции штамма LIVP VACV на уровень их защиты от высоковирулентного вируса эктромелии (оспы мышей).

Материал и методы

Вирусы, культура клеток. В работе использовали клон 14 штамма Л-ИВП (LIVP) VACV [22], а также вирус эктромелии (Ectromelia virus, ECTV) штамм K-1. Вирусы выращивали и титровали на культуре клеток линии CV-1 из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Животные. В исследованиях использовали мышей линии BALB/c, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Манипуляции на животных были проведены с одобрения комитета по биоэтике ФБУН «ГНЦ ВБ "Вектор"» Роспотребнадзора (Протокол №ГНЦ ВБ «Вектор»/02-06.2022 от 28.06.22).

Иммунизация мышей. Иммунизацию самок мышей линии BALB/c возрастом 6—7 недель (массой 16—19 г) осуществляли методом внутрикожной инъекции (в/к) при 1-кратном и 2-кратном введении VACV LIVP в дозе 10⁵ бляшкообразующих единиц (БОЕ) и при 1-кратном введении в дозе 10⁶ БОЕ.

Вирусный материал или физиологический раствор (контрольная группа) вводили в/к с помощью шприца с иглой 30G (0,3×13 мм) в объеме 20 мкл как описано [23].

Через 14, 28, 42, 56, 112 и 140 дней после вакцинации (дпв) вирусом LIVP у мышей проводили забор проб крови из ретроорбитального венозного синуса и из индивидуальных образцов крови мышей были получены препараты сывороток, как описано [23]. Образцы сывороток хранили при температуре минус 20 °C.

Иммуноферментный анализ сывороток крови. ИФА индивидуальных сывороток крови мышей выполняли, как описано ранее [24]. Вычисляли средние геометрические значения логарифмов обратного титра VACV-специфических IgG по экспериментальным группам и рассчитывали доверительные интервалы для уровня 95% вероятности совпадения каждой выборки с генеральной совокупностью.

Оценка уровня протективности у иммунизированных мышей. На 142 дпв группы иммунизированных вирусом LIVP и контрольных животных заражали и/н ECTV K-1 в дозе 2,2·10³ БОЕ/мышь. За животными наблюдали и регистрировали у них клинические проявления инфекции и их гибель.

Использовали балльную оценку выявляемых симптомов заболевания: 0 — признаков заболевания нет, 1 — легкая взъерошенность шерсти, 2 — сильная взъерошенность шерсти, 3 — сильная взъерошенность шерсти, а также сутулая поза или конъюктивит, 4 — затрудненное дыхание или отсутствие движения, 5 — гибель.

Мышей индивидуально взвешивали каждые 2 дня. Средние арифметические значения массы тел мышей для каждой группы на временную точку рассчитывали и выражали в процентах от начального веса.

Статистический анализ данных. Статистическую обработку и сравнение результатов проводили стандартными методами, используя пакет компьютерных программ Statistica 13.0 (StatSoft Inc. 1984—2001). Ранговый дисперсионный анализ значимых различий выборок данных с p<0,05 проводили методом Краскела—Уоллиса [25].

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что при в/к вакцинации мышей линии Balb/c препаратом VACV LIVP в низкой дозе 10⁴ БОЕ максимальный титр вирусспецифичных IgG достигается на 21—28 дпв и затем снижается [26]. Для эффективной профилактической вакцинации необходимо находить условия, обеспечивающие долговременное сохранение высокого уровня противовирусных антител в организме. Поэтому в данной работе для изучения того, как доза вируса и кратность его введения при в/к вакцинации мышей влияют на динамику накопления вирусспецифичных IgG и уровень защиты вакцинированных животных от летальной ортопоксвирусной инфекции, использовали дозы VACV LIVP 10⁵ и 10⁶ БОЕ. При этом в дозе 10⁵ БОЕ вирус вводили либо однократно, либо двукратно с интервалом 28 дней, а в дозе 10⁶ БОЕ — только однократно.

Через 14, 28, 42, 56, 112 и 140 дпв у мышей проводили прижизненный забор проб крови и получали сыворотки, в которых определяли методом ИФА концентрацию VACV-специфичных IgG. При анализе результатов этих измерений, приведенных на рис. 1, получены доказательства, что на 28 дпв уровень антител у мышей, вакцинированных VACV LIVP в дозе 10⁶ БОЕ, достоверно превышает аналогичный уровень у мышей, вакцинированных этим же вирусом в дозе 10⁵ БОЕ. Повторная иммунизация мышей VACV LIVP в дозе 10⁵ БОЕ на 28 дпв привела к значительному увеличению биосинтеза вирусспецифичных IgG и в период от 42 до 140 дпв зарегистрировали, что уровень анализируемых антител в этой группе мышей соответствовал аналогичному показателю для группы мышей, однократно вакцинированных VACV LIVP в дозе 10⁶ БОЕ. При этом мыши, вакцинированные этим же вирусом однократно в дозе 10⁵ БОЕ, продуцировали достоверно меньший уровень противовирусных антител (см. рис. 1).

Рис. 1. Титры VACV-специфичных IgG в сыворотках крови мышей, иммунизированных однократно в дозах 1·10⁵ или 1·10⁶ БОЕ, а также двукратно в начале эксперимента и на 28-й день после первой иммунизации (2·10⁵ БОЕ).

К — сыворотки крови мышей, которым вводили физиологический раствор. Скобками со звездочкой отмечены группы мышей, которые достоверно различаются между собой, согласно результатам рангового дисперсионного анализа методом Краскела—Уоллиса с p<0,05.

В период 112—140 дпв уровень IgG для групп животных, иммунизированных дважды в дозе 10⁵ и однократно в дозе 10⁶ БОЕ, сохранялся на одном высоком уровне, в то время как в группе мышей, однократно иммунизированных в дозе 10⁵ БОЕ, снижался (см. рис. 1).

На 142 дпв группы иммунизированных вирусом LIVP и контрольных животных и/н заражали ECTV K-1 в дозе 2,2·10³ БОЕ/мышь. У мышей, дважды вакцинированных в дозе 10⁵ БОЕ и однократно в дозе 10⁶ БОЕ, наблюдали схожую кинетику умеренных клинических проявлений инфекции (рис. 2) с максимумом на 8-й день после заражения ECTV. В группе мышей, однократно иммунизированных VACV LIVP в дозе 10⁵ БОЕ, клинические проявления развивались с 6-го по 14-й день по нарастающей картине вплоть до гибели всех особей (см. рис. 2).

Рис. 2. Динамика клинических проявлений инфекции у мышей, иммунизированных вирусом LIVP в дозе 10⁵ БОЕ однократно или двукратно, а также однократно в дозе 10⁶ БОЕ после их интраназального заражения ECTV на 142-й день после вакцинации.

Приведены средние значения для групп из 10 животных, иммунизированных VACV LIVP в соответствующей дозе, а также не иммунизированных групп и групп не инфицированных (отрицательный контроль) или зараженных ECTV (положительный контроль).

Часто используемым показателем уровня протективности изучаемых ортопоксвирусных вакцин является контроль массы тела вакцинированных мышей после заражения их летальными дозами гетерологичного высоковирулентного ортопоксвируса [26, 27]. В данной работе снижение массы тела экспериментальных животных, как и клинические проявления инфекции, наблюдали, начиная с 6 дня после заражения мышей ECTV (рис. 3). По динамике изменения массы тела мыши, дважды вакцинированные в дозе 10⁵ БОЕ и однократно в дозе 10⁶ БОЕ, демонстрировали схожую картину.

Рис. 3. Динамика изменения массы тела мышей, иммунизированных вирусом LIVP в дозе 10⁵ БОЕ однократно или двукратно, а также однократно в дозе 10⁶ БОЕ после их интраназального заражения ECTV на 142-й день после вакцинации.

Приведены данные для групп из 10 животных, иммунизированных VACV LIVP в соответствующей дозе, а также не иммунизированных групп и не инфицированных (отрицательный контроль) или зараженных ECTV (положительный контроль).

Все животные контрольной группы (невакцинированные) погибли к 8 дню после заражения ECTV, а вакцинированные VACV LIVP однократно в дозе 10⁵ БОЕ — к 14-му дню. При этом в группах мышей, дважды вакцинированных в дозе 10⁵ БОЕ и однократно в дозе 10⁶ БОЕ, выжило по 80% особей (рис. 4).

Рис. 4. Динамика гибели мышей, иммунизированных вирусом LIVP в дозе 10⁵ БОЕ однократно или двукратно, а также однократно в дозе 10⁶ БОЕ после их интраназального заражения ECTV на 142-й день после вакцинации.

Приведены данные для групп из 10 животных, иммунизированных VACV LIVP в соответствующей дозе, а также не иммунизированных групп и не инфицированных (отрицательный контроль) или зараженных ECTV (положительный контроль).

Полученные результаты подтверждают, что уровень VACV-специфичных IgG определяет уровень иммунной защиты экспериментальных животных от повторной ортопоксвирусной инфекции, что находится в соответствии с результатами наблюдений других авторов [28].

Заключение

Результаты экспериментов предыдущей [26] и данной работы показывают, что для сохранения долговременного антительного и протективного иммунного ответа на вакцинацию живым VACV необходимо применять высокую дозу вакцины. В том случае, если использованная доза вакцины не обеспечивает достаточно высокий уровень специфичных IgG, необходимо проводить повторную иммунизацию.

Финансирование работы. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда №19-14-00006-П.

Соблюдение этических стандартов. Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях. Манипуляции на животных были проведены с одобрения комитета по биоэтике ФБУН «ГНЦ ВБ "Вектор"» Роспотребнадзора (Протокол №ГНЦ ВБ «Вектор»/02-06.2022 от 28.06.22).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.