Введение

Анаэробные бактерии являются представителями микробиоты человека и чаще относятся к условно-патогенными микроорганизмам, которые способны вызывать инфекционные осложнения в абдоминальной хирургии, стоматологии и отоларингологии и органах репродуктивной системы, а также генерализованные инфекции. Инфекции, вызванные облигатно-анаэробными бактериями, достаточно часто протекают в тяжелой форме и могут нести высокий риск для жизни, в особенности для полиморбидных пациентов [1]. Сложности, связанные с лабораторной диагностикой анаэробных инфекций, ориентируют врачей на эмпирическое назначение препаратов широкого спектра действия при лечении инфекций, вызванных анаэробами [2]. Политика эмпирического назначения антибиотиков широкого спектра действия ведет к росту антибактериальной резистентности во всем мире, в том числе среди анаэробов [2—5]. Стоит отметить, что сложно установить связь между результатами тестирования чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) in vitro и клинической эффективностью лечения анаэробных инфекций, но многие исследователи отмечают высокие показатели эффективности результатов лечения и низкий уровень смертности от септических состояний при назначении антибиотиков со спектром активности в отношении анаэробов [6-8].

До сих пор ведется дискуссия между микробиологами и врачами клинических специальностей относительно необходимости тестирования чувствительности анаэробов к АБП. И если одни врачи отмечают необходимость лабораторного тестирования облигатных анаэробов, то другие считают эффективными схемы эмпирической терапии [9—11].

Изучив опыт разных исследователей и результаты, полученные специалистами при лечении инфекций, вызванных анаэробными бактериями, стоит отметить, что в ряде случаев посев биологических образцов при интраабдоминальных инфекциях и тестирование чувствительности к АБП способствует изменению схемы лечения у пациентов с устойчивыми к антибиотикам штаммами микроорганизмов (включая анаэробы), тем самым обеспечивая лучший клинический результат. Однако, учитывая длительность, сложность и дороговизну культурального исследования, а также сроки выполнения посева на анаэробы, решить вопрос эффективности такой терапии возможно с внедрением в практическую медицину методов молекулярно-генетического тестирования как анаэробных бактерий, так и генов антибиотикорезистентности [10—13].

Особую озабоченность вызывают проблемы лабораторной диагностики инфекций, вызванных облигатно-анаэробными бактериями, связанные как с трудностью взятия, культивирования анаэробов, так и с неоднозначностью применения различных методов тестирования чувствительности к АБП, сложностями методологии интерпретации результатов для разных методов и ограничениями применения тест-систем для определения чувствительности в Российской Федерации.

Таким образом, важным направлением в лечении анаэробных инфекций с учетом чувствительности выделенных штаммов является поиск «быстрых» методов лабораторного тестирования облигатно-анаэробных бактерий и генов резистентности к АБП. На современном этапе развития диагностики анаэробных инфекций внедрение новых технологий и разработка тест-систем для детекции анаэробов и детерминант резистентности к АБП является приоритетным и перспективным направлением.

Антибиотикорезистентность основных видов анаэробных бактерий

В 2006 г. Райтом с соавторами была сформулирована концепция антибиотической резистомы: совокупности генов устойчивости к антибиотикам патогенных микроорганизмов, клинических изолятов, продуцентов антибиотиков и непатогенных штаммов, доминирующих в данном ареале. Способность бактерий к распространению генетических детерминант антибиотиков, переносимых на плазмидах, конъюгативных транспозонах и интегрированных элементах способствует распространению генов антибиотикорезистентности, тем самым усугубляя всемирную проблему резистентности к АБП. В этой связи бактерии микробиоты могут быть резервуаром генов антибиотикорезистентности и участвовать в передаче этих генов другим микроорганизмам, которые являются как представителями микробиоты кишечника, так и транзиторной кишечной микробиоты [4, 5].

Одной из распространенных групп анаэробов, входящих в состав микробиоты кишечника, являются бактерии рода Bacteroides. В состав микробиоты кишечника входят около 60 видов бактероидов. Анализ 16S рРНК показал, что наиболее частыми видами среди Bacteroides, выделенными из образцов фекалий человека, являются B. acidifaciens, B. caccae, B. eggerthii, B. fragilis, B. ovatus, Parabacteroides (B.) distasonis, B. thetaiotaomicron, B. vulgatus и B. uniformis [14]. По данным зарубежных исследований [15], менее 3% изолятов Bacteroides устойчивы к пенициллину и ампициллину, но более 90% бактероидов обладают чувствительностью в отношении ингибиторозащищенных пенициллинов и цефалоспоринов, а 98—99% штаммов чувствительны к карбапенемам [2]. Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам обусловлена генами cepA и cfxA. Хромосомный ген cepA представляет собой цефалоспориназу, кодирующую устойчивость к цефалоспоринам и аминопенициллинам, но при этом сохраняется чувствительность к пиперациллину и ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам. Ген cfxA кодирует высокий уровень устойчивости к цефокситину и другим β-лактамам [16]. Хотя β-лактамазы являются основным механизмом устойчивости к пенициллинам, экспрессия измененных пенициллинсвязывающих белков также может приводить к устойчивости [15]. Карбапенемы оказывают значительное антибактериальное действие на анаэробы. Наиболее распространенные в клинической практике карбапенемы (имипенем, меропенем, эртапенем и дорипенем) эффективны in vitro в отношении B. fragilis. Устойчивость к карбапенемам обычно определяется ферментом металло-β-лактамазой и кодируется геном cfiA [17, 18]. Устойчивость к клиндамицину определяется генами erm, расположенными на плазмидах, которые также могут нести гены устойчивости к тетрациклину. Устойчивость B. fragilis к метронидазолу определяется геном nim [17, 19, 20], но в ряде исследований показано, что фенотипически это проявляется редко и важным этапом в определении чувствительности бактероидов к метранидазолу является определение минимальной ингибирующей концентрации [21]. Резистентность к моксифлоксацину опосредована мутациями гена gyrA, эффлюксными насосами или модификациями гена топоизомеразы, что определяет различные данные по чувствительности бактероидов к данному препарату — 30—60% резистентных штаммов B. fragilis [22, 23].

Нужно отметить, что различные виды бактероидов проявляют разный уровень резистентности в отношении β-лактамных антибиотиков. Наиболее чувствительными являются штаммы Parabacteroides distasonis, а B. thetaiotaomicron отмечают высокий уровень резистентности к данной группе АБП. Во многих исследованиях также указывается на различный уровень резистентности в зависимости от вида бактерий рода Bacteroides [17—20].

Виды Porphyromonas характеризуются высокой чувствительностью к β-лактамам, клиндамицину и метронидазолу. По сравнению с Porphyromonas примерно 95% видов Prevotella устойчивы к пенициллину и ампициллину [24, 25]. Чувствительность к моксифлоксацину, метронидазолу, карбапенемам и амоксициллин-клавуланату обычно составляет более 90%. Устойчивость к пенициллину у видов Fusobacterium колеблется от 4% до 15% и обычно обусловлена выработкой β-лактамаз [25]. Чаще всего сообщается, что Fusobacterium varium, Fusobacterium mortiferum и Fusobacterium nucleatum продуцируют β-лактамазы, а более 90% Fusobacterium necrophorum чувствительны к цефалоспоринам и цефамицинам. Виды Fusobacterium обычно чувствительны к метронидазолу, цефалоспоринам, карбапенемам и клиндамицину [26]. В исследовании, проведенном Y. Castillo, в геноме превотелл чаще были обнаружены tetQ — 43,3%, tetM — 36,6%, bla TEM — 26,6%, ermF — 20%, cfxA, cfxA2 и nimAB — 16,6% и nimAEFI — 3,3%.

Среди грамположительных бактерий кишечной микробиоты достаточно большая роль в развитии анаэробных инфекций принадлежит спорообразующим грамположительным бактериям рода Clostridiales.

Clostridium perfringens — анаэробная грамположительная спорообразующая палочка, ассоциированная с острыми желудочно-кишечными инфекциями различной степени тяжести — от диареи до некротизирующего энтероколита и мионекроза у человека. Клостридиальные инфекции мягких тканей и сепсис являются неотложными состояниями с неоднозначным прогнозом. Ранняя диагностика и лечение данной инфекции, включая хирургическую обработку раны, имеют жизненно важное значение. Даже при соответствующем лечении смертность от инфекций, вызванных C. perfringens, составляет 20—30%, тогда как без лечения смертность составляет 100% [27].

Во всем мире зарегистрированы устойчивые к антибиотикам штаммы Clostridiales, включая C. difficile, C. tetani, C. perfringens и C. botulinum [28]. В Таиланде большинство изолятов C. perfringens, выделенных из фекалий свиней и человека, были устойчивы к тетрациклину (приблизительно 77% и 45% соответственно) [29]. Исследователи из Саудовской Аравии отмечают, что среди штаммов C. perfringens устойчивость к антибиотикам составила: 21% к метронидазолу, 39% к клиндамицину, 59% к пенициллину, 62% к эритромицину и 47% к линкомицину [30]. Несмотря на высокий (до 75%) уровень резистентности к тетрациклину штаммов C. perfringens, выделенных в прицеводстве, данных в отношении резистентности у людей недостаточно [31, 32]. Низкая активность отмечается к ампициллину, аминогликозидам, триметоприм-сульфаметоксазолу. Во всем мире отмечают рост резистентных штаммов клостридий в отношении клиндамицина. Устойчивость к клиндамицину характерна для многих видов, включая C. tertium, C. difficile, C. ramosum, C. innocuum и C. clostridioforme [30, 33, 34].

Clostridium difficile является облигатным анаэробом, обладающим достаточно высоким уровнем устойчивости к АБП. Бактерия вызывает антибиотик-ассоциированную диарею и псевдомембранозный колит и в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» входит в группу ESCAPE-патогенов, вызывающих тяжелые инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП) [35]. C. difficile — представитель микробиоты кишечника примерно у 3% здоровых взрослых и 20% новорожденных детей [36, 37]. В 33% случаев бактерия является причиной антибиотик-ассоциированной диареи и в 90% случаев псевдомембранозного колита [38]. Терапия АБП широкого спектра действия способствует колонизации и распространению C. difficile в кишечнике и развитию инфекций, вызванных C. difficile (CDI).

В клинических рекомендациях, разработанных специалистами Ассоциации колопроктологов России, рекомендован трехэтапный алгоритм исследования Clostridium difficile-ассоциированной инфекции для быстрого и полного лабораторного выявления антибиотик-ассоциированной диареи, скрининга пациентов, поступающих в отделения эпидемиологического риска, для обеспечения правильной и своевременной диагностики, локального микробиологического мониторинга и эпидемиологического надзора за CDI [39, 40].

При изучении антибиотикочувствительности штаммов C.difficile отмечается, что они обычно чувствительны к метронидазолу и ванкомицину, но устойчивы к β-лактамам, фторхинолонам и клиндамицину [41]. Недавнее эпидемиологическое исследование изолятов C. difficile, собранных в 14 европейских странах, показало, что более половины изолятов обладали множественной лекарственной устойчивостью, причем большинство из них были устойчивы к моксифлоксацину, клиндамицину, эритромицину и рифампицину [42].

Препаратами выбора для лечения CDI служат метронидазол и ванкомицин. Однако широкое применение этих препаратов несет угрозу развития резистентности среди штаммов внутрибольничного распространения. Эффективность ванкомицина достаточно высока при лечении CDI, и в 95% случаев наступает излечение, но также отмечается возможный рецидив у 15—30% пациентов. Необходимо учитывать и высокую вероятность формирования ванкомицинрезистентных штаммов C. difficile за счет горизонтальной передачи генов антибиотикорезистентности в условиях реанимационных отделений, где высокий процент ванкомицинрезистентных энтерококков [43, 44].

Еще одними из широко представленных анаэробных бактерий в составе микробиоты кишечника являются анаэробные грамположительные кокки, которые претерпели серьезные таксономические изменения за последние 40 лет. Известно, что более 90% анаэробных кокков чувствительны к β-лактамам (пенициллину, цефалоспоринам и карбапенемам) и развитие резистентности к ним чаще связано с изменениями в пенициллинсвязывающем белке [45, 46]. Уровень устойчивости к клиндамицину среди анаэробных кокков колеблется от 7% до 20%, и эта устойчивость особенно возрастает у видов Finegoldia magna и Peptoniphilus [26, 32]. Среди этой группы анаэробов 90—95% чувствительны к метронидазолу, но описаны редкие nimB-положительные и резистентные к метронидазолу штаммы F. magna и Parvimonas micra [32, 47].

Методы определения чувствительности облигатно-анаэробных бактерий к антибактериальным препаратам

Микробиологическое исследование на чувствительность к АБП проводятся в отношении облигатно-анаэробных бактерий, являющихся этиологически значимыми возбудителями заболевания, особенно если предполагается, что выделенная бактерия может проявлять устойчивость к АБП, которые эмпирически назначаются для лечения данной инфекции. Исследование по определению чувствительности к АБП также важно при наблюдении за формированием у бактерий резистентности к антибиотикам, при эпидемиологических исследованиях распространения резистентных штаммов, а также при анализе риска формирования новых штаммов бактерий. В арсенале микробиологов в настоящее время имеются ограниченные возможности тестирования чувствительности облигатно-анаэробных бактерий к антибиотикам.

Референтным методом определения чувствительности облигатно-анаэробных бактерий является метод серийных разведений, который применяется для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) для тестирования in vitro на чувствительность к АБП. Относительно значений МПК, установленных референтным методом, «калибруются» в рутинной практике диско-диффузионный метод (ДДМ) и различные коммерческие методы определения чувствительности, реализованные для бактериологических анализаторов различных производителей [48].

Еще одним из более распространенных методов тестирования облигатно-анаэробных бактерий является метод градиентной диффузии, реализованный в коммерчески доступных тест-полосках (Е-тест). Питательные среды для определения чувствительности, а также условия культивирования определяются на основании тестируемого вида бактерии в соответствии с актуальной версией клинических рекомендаций «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (КР). Интерпретация результатов по МПК проводится на основании КР или с использованием программного обеспечения автоматических бактериологических анализаторов и применением коммерчески доступных тест-систем [49]. Для тестирования облигатно-анаэробных бактерий в Российской Федерации доступны коммерческие полоски различных зарубежных производителей. В настоящее время отсутствуют тест-полоски для определения МПК отечественного производства.

В исследовании A.N. Schuetz проведена сравнительная оценка различных методов определения чувствительности анаэробных бактерий к АБП и указаны основные достоинства и недостатки. В работе отмечается, что метод серийных разведений в агаре и бульоне является достаточно трудоемким, требующим профессиональных навыков выполнения, времязатратным и доступен при наличии достаточной микробной культуры, а также имеет ограничения для некоторых видов бактерий. Достоинствами метода указаны референтность (метод разведения в бульоне), возможность тестирования к большому количеству АБП. Как преимущество метода градиентной диффузии отмечено простота и удобство в исполнении, получение количественной характеристики (МПК), возможность одновременной постановки нескольких препаратов. В качестве ограничений метода обозначены дороговизна Е-тестов и недостоверность данных для некоторых АБП [2].

Тестирование чувствительности к АБП у анаэробов основано в первую очередь на фенотипической характеристике. Рекомендации по проведению определения чувствительности к АБП разрабатываются институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI), и эти стандарты признаны лабораториями, аккредитующими организациями и государственными учреждениями по всему миру. В Российской Федерации за основу клинических рекомендаций «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» приняты рекомендации, предлагаемые Европейским комитетом по определению чувствительности к антибиотикам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing — EUCAST). Иногда между рекомендациями CLSI и EUCAST существуют различия в критериях интерпретации, которые можно объяснить различиями в дозировках, интервалах введения, количестве инокулята или питательных средах для тестирования. В последние годы в версиях клинических рекомендаций, принятых в Российской Федерации, появляется все больше данных для интерпретации результатов тестирования облигатных анаэробов доступными методами (Е-тесты, ДДМ), что внушает оптимизм в отношении тестирования анаэробов к антибиотикам в более широком исполнении в рутиной практике микробиологических лабораторий.

С широким внедрением в работу микробиологических лабораторий автоматизированных молекулярных методов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием картриджей или устройства на основе петлевой изотермической амплификации повысилась доступность определения детерминант резистентности бактерий. Несмотря на то что молекулярная диагностика в отношении известных маркеров резистентности высокочувствительна, что является ее бесспорным преимуществом, нет убедительных доказательств ее экономической эффективности или доступности применения. Недостаточное понимание механизмов резистентности может препятствовать использованию молекулярных методов диагностики для некоторых патогенов, в частности анаэробов. Тем не менее, поскольку стоимость молекулярной диагностики снижается, а знания о генетических механизмах резистентности становятся все более обширными, такие методы в будущем станут ценным инструментом, доступным для эпидемиологического надзора за резистентностью в лабораториях любого уровня [50].

Еще одной из перспективных технологий для применения в области изучения анаэробных микроорганизмов является такой метод, как матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS). Перспективным направлением для применения MALDI-TOF MS в клинической микробиологии является разработка быстрых и надежных методов идентификации и тестирования чувствительности к АБП. В настоящее время в ряде исследований российских и зарубежных исследователей изучается возможность применения технологии MALDI-TOF MS для быстрого выявления как штаммовых свойств, так и устойчивости к антибиотикам бактерий и грибов [51—55]. Идентификация маркеров антибиотикорезистентности с помощью MALDI-TOF MS исследовалась также на анаэробах. В исследовании E. Nagy и соавт. представлены возможности выявления гена cfiA у B. fragilis по набору сдвигов пиков в интервале 4000—5500 Да с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). Были созданы два референтных спектра для штаммов B. fragilis, у которых этот ген присутствует и которые их лишены [56]. В другом исследовании, проведенном Å. Johansson и соавт., был разработан протокол для обнаружения карбапенемазной активности B. fragilis путем изучения гидролиза эртапенема с помощью MALDI-TOF MS [57].

Заключение

Изучив проблему тестирования штаммов облигатно-анаэробных бактерий к АБП, можно отметить, что процедура исследования в настоящее время является достаточно трудоемкой, ресурсозатратной, ограниченной по данным интерпретации, представленным в нормативных документах, и вследствие этого редко применяемой в рутинной практике микробиологических лабораторий. При назначении антибактериальной терапии пациентам с инфекцией, вызванной анаэробами, актуальность лабораторного тестирования определяется необходимостью назначения этиотропной терапии при длительных схемах терапии и частых сменах антибиотиков, а также при выделении анаэробов из стерильных локусов. Необходимо отметить и то, что чувствительность облигатно-анаэробных бактерий различается в зависимости от вида микроорганизма, а также при выделении у пациентов различного профиля (хирургических, терапевтических, травматологических и др.) и даже различных регионов. Эпидемиологические исследования указывают на то, что чувствительность анаэробов различается в разных регионах мира и имеет тенденцию к росту устойчивости. Динамический мониторинг антибактериальной резистентности анаэробов может улучшить процесс принятия клинических решений, предоставить информацию для усилий по рациональному использованию антибиотиков и помочь сформировать стратегию инфекционного контроля в отношении инфекций, вызванных анаэробами, для улучшения результатов лечения пациентов и повышения качества медицинской помощи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.