На сегодняшний день секвенирование нового поколения (next generation sequencing — NGS) является основной исследовательской методикой, позволяющей выявлять рекуррентные соматические мутации (горячие точки), изменения копийности и перестройки генов, наследственные патогенные варианты и другие генетические изменения, ассоциированные со злокачественными новообразованиями (ЗНО). Расширение представлений о молекулярной эпидемиологии ЗНО служит основой для разработки разнообразных тест-систем на основе стандартных методов молекулярно-генетического исследования (МГИ): полимеразной цепной реакции (ПЦР), флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization, FISH) или иммуногистохимического (ИГХ) исследования, обнаруживающих наиболее частые и клинически значимые изменения. Помимо исследовательского применения, NGS в последние годы находит все большее распространение в повседневной клинической практике [1]. Метод обладает намного большей информативностью по сравнению с перечисленными методиками МГИ. Результаты NGS в первую очередь помогают при выборе таргетной терапии, но также могут выявлять наследственные варианты нуклеотидной последовательности (далее — варианты), вызывающие развитие опухолевых синдромов; варианты, имеющие диагностическое и прогностическое значение; индивидуальные опухолевые варианты, применимые для мониторинга минимальной остаточной болезни. Метод NGS может использоваться для секвенирования не только ДНК, но и РНК. Секвенирование ДНК позволяет в первую очередь выявлять небольшие варианты нуклеотидной последовательности (до 50 пар нуклеотидов) [2], а также амплификации или делеции протяженных участков ДНК [3]. Секвенирование РНК в клинической практике в основном применяется для исследования перестроек генов [4]. Также секвенирование РНК может использоваться для анализа транскриптома, однако такой подход на сегодняшний день не доказал своей клинической эффективности [5].

Таким образом, метод NGS позволяет находить те же молекулярно-генетические изменения, что и стандартные методы МГИ:

1. Короткие варианты нуклеотидных последовательностей выявляются при помощи ПЦР, секвенирования по Сэнгеру, реже — ИГХ-исследования.

2. Изменения копийности генов выявляются FISH.

3. Изменение экспрессии генов выявляется с помощью ИГХ-исследования (на уровне белка), ПЦР (на уровне РНК).

4. Перестройки генов выявляются FISH, ПЦР.

Ключевое преимущество NGS — способность определять ранее не описанные или редкие варианты. Однако метод имеет ряд важных ограничений:

1. Время выполнения анализа может составлять около 20 дней, что является важным фактором, ограничивающим применение методики [6].

2. Отсутствие клинических рекомендаций и руководств, позволяющих использовать результаты NGS для исследования некоторых распространенных биомаркеров (например, амплификации HER2 при раке молочной железы — РМЖ) [7].

3. Избыточность информации NGS в реальной клинической практике в некоторых случаях может затруднить интерпретацию результатов и потенциально привести к неоправданному назначению off-label-терапии [8].Перечисленные ограничения в ряде случаев могут быть преодолены за счет дополнения либо замены NGS-исследования стандартными методами МГИ, обладающими значительно меньшим временем выполнения анализа, стандартизованными в рамках клинических руководств и имеющими четкие критерии интерпретации результатов.

В настоящем обзоре рассматриваются актуальные примеры интеграции NGS со стандартными методикам МГИ для получения оптимальной диагностической производительности, чувствительности и экономической эффективности.

Гармонизация применения ПЦР-тестов с актуальными данными молекулярной эпидемиологии

Данные, получаемые методом NGS в клинической практике, корректируют представления о молекулярной эпидемиологии ЗНО, что в свою очередь дает основания к актуализации существующих ПЦР-тестов и алгоритмов их применения.

Герминальные и соматические варианты в генах BRCA1 и BRCA2

Распространенные в России ПЦР-системы для поиска наследственных патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 включают 8 мутаций, которые, как считалось ранее, позволяют выявить большинство пациенток с наследственным РМЖ и раком яичников [9]. Исследования с использованием NGS позволили обнаружить, что эти варианты, во-первых, являются этноспецифичными для славянской популяции [10], во-вторых, даже в этой популяции использование таких ПЦР-тестов позволяет охватить лишь 50% больных, имеющих патогенные варианты [11]. Использование таких тест-систем для других популяций оказывается еще менее информативным [12]. Полученные данные привели к изменению стандартной схемы диагностики носительства мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: на первом этапе применяется предварительный ПЦР-скрининг для поиска наиболее часто встречающихся мутаций, в случае негативного результата необходимо проводить расширенное тестирование с помощью NGS-тестов. При раке яичников в случае негативного результата ПЦР-теста рекомендовано проведение NGS- тестирования на образце опухоли с целью выявления как редких герминальных, так и соматических вариантов [13]. При этом для РМЖ определение соматических вариантов менее актуально, так как эффективность ингибиторов PARP при их наличии обоснована в меньшей степени, чем для рака яичников [1].

Соматические варианты в гене PIK3CA

Выявление активирующих соматических вариантов в гене PIK3CA стандартно осуществляется с помощью ПЦР-тестов. Исследования, проводившиеся в эпоху до появления NGS и выявившие наиболее частые горячие точки в экзонах 7, 9 и 20 гена PIK3CA [14], легли в основу применения метода ПЦР для детекции вариантов в этом гене. В исследовании эффективности комбинации ингибитора PIK3CA алпелисиба с фулвестрантом SOLAR-1 для обнаружения вариантов у пациенток с метастатическим гормонозависимым РМЖ использовалась тест-система Therascreen® PIK3CA RGQ PCR Kit (QIAGEN GmbH) (далее — Therascreen) [15]. Эта тест-система позволяет выявлять 11 аминокислотных замен в экзонах 7 (C420R), 9 (E542K, E545A, E545D, E545G, E545K, Q546E, Q546R) и 20 (H1047L, H1047R, H1047Y) и была зарегистрирована Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and drug administration — FDA) для клинического применения. Более поздние исследования с применением NGS продемонстрировали, что Therascreen выявляет активирующие варианты в гене PIK3CA лишь у 80% пациенток [16]. Некоторые тест-системы, разработанные позже, охватывают больший спектр клинически значимых вариантов в PIK3CA. Например, тест-система cobas® PIK3CA Mutation Test выявляет 17 аминокислотных замен, дополнительно включая экзоны 1 и 4 [17]. Эта тест-система используется в клинических целях в Европе, однако не зарегистрирована для этого в США. Это объясняется тем, что в исследовании SOLAR-1 была оценена клиническая значимость только вариантов, входящих в состав Therascreen. Однако в более поздних работах было показано, что варианты PIK3CA, не входящие в Therascreen, также ассоциированы с ответом на комбинацию алпелисиба с фулвестрантом. В исследовании 33 977 образцов ДНК ткани и 1587 образцов свободной циркулирующей ДНК (сцДНК) плазмы крови с использованием NGS-тест-систем FoundationOne (Foundation Medicine, Inc.) показано, что в группе с вариантами, не изучавшимися в SOLAR-1, пациенты, получавшие комбинацию алпелисиба с фулвестрантом, выигрывали по сравнению с лицами, пролеченными только фулвестрантом. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 4 мес (95% ДИ: 2,8—10,1) против 2,5 мес (95% ДИ: 2,2—3,7; p=0,0054) [18]. Таким образом, применение NGS в реальной клинической практике значительно обогатило представления о спектре клинически значимых вариантов в PIK3CA. Исследование дополнительных вариантов в PIK3CA как с помощью NGS, так и с использованием расширенных ПЦР-тестов оправдано с клинической точки зрения.

Интеграция NGS со стандартными методами МГИ для определения структурных генетических вариантов

Амплификации генов

HER2-положительный РМЖ диагностируется с помощью ИГХ-исследования. В случае пограничной экспрессии дополнительно оценивается увеличение копийности гена (амплификация) с использованием FISH согласно руководству ASCO-CAP 2023 [19]. При этом NGS также позволяет выявлять амплификации HER2. Метод с применением NGS-тест-системы FoundationOne CDx зарегистрирован FDA в качестве сопроводительной диагностики для РМЖ. Положительной считается копийность выше 8. При этом значение копийности более 3, но менее 8 расценивается как неоднозначный результат и требует валидации стандартными методами [20]. При этом следует учитывать, что тесты FoundationOne валидированы на очень больших выборках пациентов. Применение других невалидированных NGS-тест-систем для определения амплификаций HER2 при РМЖ может быть сопряжено с ошибочными результатами и не рекомендовано для рутинного определения статуса HER2 при РМЖ.

Согласно действующему руководству Национальной всеобщей онкологической сети (National Comprehensive Cancer Network — NCCN), NGS рассматривается как возможный метод определения амплификаций HER2 при раке ободочной кишки наравне с ИГХ-исследованием и FISH [21]. При этом авторы статьи [22], на которую ссылается руководство, отмечают, что выявленная NGS амплификация HER2 не всегда сопровождается повышением экспрессии, и рекомендуют валидировать результаты с помощью ИГХ-метода.

Согласно действующему руководству NCCN, при раке желудка NGS может быть использован для определения амплификации HER2, однако при наличии достаточного количества материала для исследования биомаркеров рекомендовано отдавать предпочтение стандартным методам МГИ [23].

Перестройки генов

Исследование 7000 опухолевых образцов с применением РНК-секвенирования позволило исследовать встречаемость перестроек генов, кодирующих киназы, в различных типах опухолей. В результате этого исследования обнаружено, что перестройки с участием нейротрофных тропомиозин-рецепторных киназ NTRK1, NTRK2, NTRK3 встречаются в широком спектре нозологий [24]. Это в свою очередь дало возможность для разработки тест-систем на основе FISH и ПЦР для выявления этих перестроек, с помощью которых были проведены клинические исследования специфических ингибиторов нейротрофной тропомиозин-рецепторной киназы (TRK), которые стали применяться агностически при любых типах ЗНО в случае наличия соответствующих перестроек [25, 26]. Среди онкологических заболеваний перестройки NTRK чаще всего встречаются при секреторном РМЖ с частотой около 90%, однако наблюдаются и при других нозологиях [27].

Согласно рекомендациям Европейского общества медицинской онкологии (European Society of Medical Oncology — ESMO) 2019 г., для ЗНО с известными рекуррентными перестройками NTRK, как, например, ETV6-NTRK3 при секреторном РМЖ, диагностику можно проводить с помощью ИГХ-метода, FISH либо NGS-теста. При малой доступности NGS-тестов рекомендуется предварительный скрининг экспрессии TRK с использованием ИГХ-исследования и с последующей валидацией положительных образцов методом NGS. В случае доступности изначально проводится исследование с помощью NGS-теста с дальнейшей валидацией экспрессии методом ИГХ-исследования [28]. Позже, в 2020 и 2022 г. для определения перестроек NTRK были зарегистрированы тесты Foundation One, не требующие дополнительной валидации положительных результатов. Однако в случае использования невалидированных NGS-тестов может быть целесообразна валидация положительных результатов ортогональными методами.

Применение метода NGS наиболее актуально для диагностики немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), так как эта нозология характеризуется самым широким спектром таргетируемых молекулярно-генетических биомаркеров, включая перестройки генов [1].

Согласно действующим клиническим руководствам и рекомендациям, для диагностики НМРЛ необходимо исследовать перестройки генов ALK и ROS1 [29]. Также возможно дополнительное исследование агностических биомаркеров — перестроек RET и NTRK1/2/3 и редкой перестройки NRG1, которая может быть таргетирована в рамках клинических исследований биспецифическим анти-HER2/HER3-препаратом [30]. Таким образом, минимальное количество необходимых для анализа перестроек составляет 2, а расширенное исследование включает 7 клинически значимых перестроек. В последнем случае становится экономически нецелесообразным проведение исследования с помощью FISH, и NGS-тест, способный выявлять все указанные перестройки, становится предпочтительным.

Валидация потенциальных герминальных вариантов, выявленных NGS-тестами, и тестирование родственников носителей патогенных мутаций

Ранее была широко распространена практика валидации выявленных при помощи NGS клинически значимых герминальных вариантов в образцах здоровой ткани секвенированием по методу Сэнгера [31]. В последние годы консенсус изменился, и такая валидация считается избыточной в случае удовлетворительного качества секвенирования [32].

Тем не менее применение секвенирования по методу Сэнгера необходимо при выявлении потенциальных герминальных патогенных вариантов во время NGS-исследования образца опухолевой ткани. Методология такого исследования даже при использовании лучших биоинформатических алгоритмов не позволяет с абсолютной точностью определить герминальный или соматический статус варианта, в связи с чем возникает необходимость его валидации на образце нормальной ткани. Такую валидацию обычно проводят секвенированием по методу Сэнгера, синтезируя для этого специфические для найденного варианта праймеры для прочтения целевого региона. В руководстве Американского общества клинической онкологии (American Society of Clinical Oncology — ASCO) 2024 г. перечислены гены, в которых при обнаружении патогенных вариантов необходимо проведение валидации их герминального статуса в зависимости от возраста пациента и нозологии [33].

При подтверждении герминального статуса патогенного варианта необходимо проведение тестирования родственников пациента. Большинство наследственных опухолевых синдромов наследуется по аутосомно-доминантному принципу. Это означает, что вероятность наличия патогенного варианта у родственников первой степени родства составляет 50%. Тестирование осуществляется по каскадному принципу: сначала проводится поиск варианта у родственников первой степени родства пробанда, затем в случае выявления патогенного варианта у родственника выполняется тестирование его родственников первой степени родства [34, 35]. В реальной клинической практике тестирование родственников проводится лишь у трети носителей патогенных вариантов [36].

Молекулярная классификация онкологических заболеваний: глиомы и рака эндометрия

Основой современной классификации глиом WHO CNS5 являются молекулярно-генетические изменения опухоли. Точная диагностика глиом требует проведения комплексного анализа множества генетических маркеров [37]. Ключевые биомаркеры, такие как мутации IDH1/2, коделеция 1p/19q, нарушения экспрессии p53 и ATRX, могут быть выявлены стандартными методами МГИ [38]. Однако для анализа всего актуального спектра биомаркеров глиом NGS сейчас рассматривается как предпочтительный метод [39].

Проведенное в 2013 г. исследование 373 карцином эндометрия в рамках проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA) с использованием интегрированного геномного, транскриптомного и протеомного анализа выявило 4 молекулярных подтипа рака эндометрия: POLE-мутантный, MMR-дефицитный, p53-мутантный, подтип без специфического молекулярного профиля [40]. Указанные подтипы широко применяются в клинической практике для стратификации пациентов на группы риска и в выборе алгоритма лечения [41]. Учитывая невозможность применения методологического арсенала TCGA в реальной клинической практике, был предложен более простой алгоритм классификации — Risk Classifier for Endometrial Cancer (ProMisE). Классификация ProMisE основана на определении экспрессии p53 и белков системы MMR с помощью ИГХ-исследования и выявлении мутаций экзонуклеазного домена POLE. Обычно статус POLE устанавливается с помощью NGS, однако может быть определен и другими методами, включая ПЦР и секвенирование по методу Сэнгера [42]. Также классификация подтипов возможна с использованием только метода NGS, при этом наибольшие (18,5%) расхождения наблюдаются при определении статуса p53 методом ИГХ и мутаций TP53 методом NGS [43].

Мониторинг остаточной болезни

Другой формой интеграции NGS-тестирования со стандартными методиками является мониторинг минимальной остаточной болезни по мутациям в сцДНК с использованием ПЦР-теста. Суть такого подхода заключается в следующем. Пациенту с резектабельной формой заболевания проводится NGS-тестирование опухоли для выявления специфических соматических вариантов. Далее для этих вариантов разрабатывается индивидуализированный высокочувствительный ПЦР-тест на основе цифровой капельной ПЦР (ddPCR), способный выявлять их в плазме крови. Наличие мутаций в циркуляции в послеоперационном периоде расценивается как негативный прогностический признак, в результате чего пациенту может быть назначена адъювантная терапия [44, 45].

Эффективность такого подхода является предметом исследований. В одной из первых работ сцДНК изучалась у 130 пациентов с резектабельным колоректальным раком. Наличие мутаций в циркуляции на 30-й день после операции было ассоциировано с 7-кратно повышенным риском рецидива (отношение рисков (ОР) 7,2; 95% ДИ, 2,7—19,0; p<0,001). При этом повышенный риск рецидива также наблюдался у пациентов, получавших адъювантную терапию [46]. Положительные результаты с точки зрения влияния на выбор терапии были получены только в исследовании GALAXY с участием 1039 пациентов с резектабельным колоректальным раком в подгруппе лиц со стадиями II и III, получавшими адъювантную терапию (ОР 6,59; p<0,0001) [47].

При РМЖ мониторинг остаточной болезни может применяться как прогностический биомаркер для стратификации пациенток по группам риска. Метаанализ исследований сцДНК при операбельном РМЖ показал, что наличие опухолевой ДНК ассоциировано со сниженной безрецидивной выживаемостью в случае выявления мутаций до начала лечения (ОР 2,98, 95% ДИ 1,92—4,63), после неоадъювантной терапии (ОР 7,69, 95% ДИ 4,83—12,24) и в течение мониторинга пациента (ОР 14,04, 95% ДИ 7,55—26,11) [48]. Несмотря на доказанное прогностическое значение, на текущем этапе такой подход имеет ограниченное применение в клинической практике, сравнимое с исследованием опухолевых маркеров.

Заключение

Широкое применение NGS в исследовательских целях в практической онкологии значительно расширило спектр молекулярно-генетических биомаркеров с прогностической и предиктивной значимостью. Некоторые биомаркеры, такие как мутационная нагрузка или дефицит гомологичной рекомбинации, могут быть исследованы только высокопроизводительными методами, однако на текущем этапе развития технологии стандартные методы МГИ остаются основой лабораторной диагностики молекулярно-генетических биомаркеров. Стандартные методы МГИ могут быть использованы не только для первичного скрининга с последующим NGS-анализом, как в случае с ПЦР-тестами для BRCA1/2, или определением экспрессии TRK, но и для валидации некоторых находок при выполнении NGS. Данные о новых горячих точках, полученные в результате активного применения NGS в клинической практике, поднимают вопрос о необходимости разработки новых тест-систем на основе ПЦР для увеличения охвата мутаций, таргетируемых лекарственными препаратами. Такие оптимизированные ПЦР-тесты могут быть сравнимы по диагностической чувствительности с NGS, в то же время выигрывая по времени выполнения анализа, аналитической чувствительности и фармакоэкономическим показателям. Создание индивидуализированных ПЦР-тестов для мониторинга минимальной остаточной болезни является перспективным направлением, которое уже показало высокую прогностическую силу с возможностью стратификации пациентов по группам риска.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.