Молекулярная диагностика SARS-CoV-2: оптимизация скорости диагностики в условиях многопрофильного стационара

В Российской Федерации в начале 2020 г. возникла сложная эпидемиологическая ситуация, связанная с появлением новой коронавирусной инфекции COVID-19. В этот период система здравоохранения претерпевала различные изменения, вызванные необходимостью поиска быстрых и точных способов решения диагностических и терапевтических задач, поставленных перед медицинскими работниками.

В связи с резким увеличением заболеваемости в Москве в ГБУЗ «МКНЦ им. А.С. Логинова» ДЗМ в мае 2020 г. была организована лаборатория для проведения диагностики SARS-CoV-2 методами полимеразной цепной реакции и петлевой изотермической амплификации с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ и SmartAmp соответственно). Данные виды исследования осуществлялись в рамках проведения комплекса предгоспитализационной подготовки, включающей в себя также иммуноферментный анализ (ИФА) крови на иммуноглобулины классов G и M и диагностическую компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки, для дальнейшего прохождения стационарного лечения пациентов. Ранняя диагностика SARS-CoV-2 имеет особо важное значение для прогнозирования течения заболевания конкретного пациента, а также вносит значительный вклад в рамках предотвращения дальнейшего распространения вирусной инфекции.

Цель данной статьи — проведение сравнительного анализа методов ПЦР-РВ и SmartAmp диагностики SARS-CoV-2 в рамках осуществления исследований в ГБУЗ «МКНЦ им. А.С. Логинова» ДЗМ.

В период с мая по июль 2020 г. проведено 8909 молекулярно-диагностических исследований SARS-CoV-2. Биологический материал получали путем забора мазков из носоглотки и ротоглотки у пациентов с помощью сухих стерильных зондов-тампонов с последующим хранением и транспортировкой образцов в специальных средах для респираторных мазков.

Для проведения ПЦР-РВ была использована тест-система для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом полимеразной цепной реакции АмплиТест SARS-CoV-2 (ФГБУ «ЦСП» ФМБА РФ, Россия). Анализ результатов проводили согласно инструкции с помощью амплификатора с детекцией в режиме реального времени CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США) и прилагающегося пакета программного обеспечения CFX Manager.

Для осуществления диагностики методом SmartAmp, модифицированной изотермической амплификации для более высокой специфичности, использовали Набор для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале методом изотермической амплификации в режиме реального времени (ООО «Эвотэк-Мирай Геномикс», Россия). Анализ результатов проводили согласно инструкции с помощью портативной мини-лаборатории для экспресс-диагностики и прилагающегося программного обеспечения AmplifierClient.

Для определения статистической значимости выявленных различий использовали критерий χ² Пирсона (p<0,01).

Основной задачей в данной работе являлось проведение сравнительного анализа методов молекулярной диагностики, используемых в ПЦР-лаборатории для обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2, на основе полученных в ходе работы данных.

За период с мая по июль 2020 г. нами исследованы 8909 образцов пациентов, поступивших в многопрофильный стационар для дальнейшего проведения лечения. В результате исследования выявлено 174 (~1,95%) положительных результата. Среди них 64 (~36,8%) мужчины, 110 (~63,2%) женщин. Исследуемая группа включала пациентов от 21 до 81 года, средний возраст составил 50,3±14,8 года. Среди 174 заболевших 103 в связи с тяжелыми клиническими проявлениями COVID-19 были госпитализированы на стационарное лечение (~59,2%), 48 (27,6%) сообщили о наличии хронических заболеваний различной этиологии.

При выявлении в образце, полученном у пациента, РНК коронавируса SARS-CoV-2 проводилось повторное исследование с использованием другой тест-системы. Нами было показано, что при сравнении результатов, полученных с помощью методов ПЦР-РВ и SmartAmp, различие не было статистически значимым (174 и 172 положительных результата из 8909 соответственно, p=0,01).

Появление новых вирусных заболеваний несет серьезную угрозу жизни и здоровью человека. Возможность ранней диагностики таких инфекций может решить целый ряд важных проблем, связанных с быстрым распространением вируса. Таким образом, оптимизация процесса проведения диагностических исследований является актуальной задачей современной медицины.

Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) считается «золотым стандартом» и повсеместно используется в клинической диагностике для обнаружения нуклеиновых кислот возбудителей различных вирусных и бактериальных инфекций [1, 2]. Данный метод молекулярной диагностики обладает высокой специфичностью, чувствительностью и производительностью. Однако его использование осложнено высокой ценой оборудования и длительностью получения результатов (4—8 ч) [3].

К настоящему времени для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот был разработан другой тип молекулярной диагностики, в котором используется метод, не основанный на ПЦР, — модифицированная петлевая изотермическая амплификация нуклеиновых кислот SmartAmp. Новый метод считается перспективным в связи с рядом преимуществ: время выполнения исследования составляет в среднем 1 ч, при проведении SmartAmp возможно совместить реакцию обратной транскрипции и реакцию амплификации ДНК, поскольку SmartAmp проходит при постоянной температуре [4, 5]. Однако пропускная способность одной портативной мини-лаборатории (ООО «Эвотэк-Мирай Геномикс», Россия) составляет всего 22 образца с учетом контролей.

Основываясь на нашем опыте лабораторной диагностики COVID-19 в ГБУЗ «МКНЦ им. А.С. Логинова» ДЗМ, можно сделать вывод о том, что параллельное использование различных методов диагностики (ПЦР-РВ и SmartAmp) позволяет значительно сократить время выполнения и увеличить количество молекулярно-диагностических исследований.

Быстрые и точные методы раннего обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 крайне важны для сдерживания и предотвращения дальнейшего распространения вирусной инфекции, а также для прогнозирования новых волн увеличения численности заболевших.

Нами было показано, что при сравнении результатов, полученных с помощью методов ПЦР-РВ и SmartAmp, различие не было статистически значимым. Следует отметить, что каждая из вышеупомянутых методик имеет как достоинства, так и недостатки. Однако при использовании метода SmartAmp в сравнении с ПЦР-РВ значительно сокращалось время проведения одного исследования (~1 ч и ~4 ч соответственно), что зачастую является лимитирующим фактором. Основываясь на проделанной работе, можно сделать вывод о том, что параллельное использование различных тест-систем позволяет значительно сократить время выполнения исследований и разделить пациентопоток в зависимости от поставленных сроков госпитализации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹ Согласно разделу «Назначение медицинского изделия» Инструкции по применению изделия «Набор для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале методом изотермической амплификации в режиме реального времени в вариантах исполнения по ТУ 21.10.60-004-06931260-2020», РУ №РЗН 2020/10088, данный метод изотермической амплификации в режиме реального времени относится к исследованиям с применением метода амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) гибридизационно-флюоресцентным методом с детекцией продукта в режиме «реального времени» (ПЦР)».