Разработка подходов к идентификации возбудителей микозов легких у больных муковисцидозом непосредственно в клинических образцах из респираторного тракта

Хроническая инфекция дыхательных путей у больных муковисцидозом (МВ) приводит к неуклонному ухудшению функции легких [1]. Наряду с бактериями Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia complex, Achromobacter spp. и др. возбудителями инфекции могут быть представители царства Fungi, роль и разнообразие которых еще недостаточно изучены. Отчет Национального регистра больных МВ США, который отличает наибольшее разнообразие упоминаемых микроорганизмов, информирует только о представителях двух родов: Candida и Aspergillus, инфицировавших в стране 7,8 и 11,9% больных МВ соответственно. Особое внимание уделено аллергическому бронхолегочному аспергиллезу (АБЛА) как следствию инфицирования аспергиллами. Если в США 5,0% всех больных МВ страдают этим осложнением [2], в Великобритании - 10,5% [3], то по последнему отчету Российского регистра в нашей стране таких больных МВ 1,4% [4]. Эти данные свидетельствуют о возможном недовыявлении АБЛА и микозов легких у больных МВ в нашей стране, тем более что, по данным GAFFI (Global Action Fund for Fungal Infection, http://www.gaffi.org/), заболеваемость хроническим легочным аспергиллезом в России в целом существенно выше (18,0 на 100 000 населения), чем в США (0,51) или Великобритании (1,6).

Отсутствие стандартизованных микологических методов для анализа образцов мокроты больных МВ не раз отмечалось в литературе [5]. Молекулярно-генетические методы более чувствительны, но коммерческие наборы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ДНК-ДНК-гибридизации преимущественно позволяют идентифицировать представителей только двух родов: Candida и Aspergillus (табл. 1

Коммерческие наборы, предполагающие использование методов секвенирования ампликонов, позволяют работать только с ДНК, выделенной из чистых культур: MicroSeq D2 LSU rDNA Fungal Identification Kit ("Applied Biosystems"), BlackLight Fungal ID Kit ("BlackBio"), Pyrosequencing ("Qiagen"). Однако для больных МВ актуальна идентификация возбудителей микозов непосредственно в образцах из дыхательных путей: мокроте, трахеальном аспирате.

В настоящее время метод масс-спектрометрии MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, Time-Of-Flight) адаптирован для прямого анализа микроорганизмов только в таком клиническом материале, как моча и кровь. Однако высокая достоверность видовой идентификации в этом случае возможна для небольшого количества видов, преимущественно рода Candida [6].

Следует отметить, что перечень мишеней, используемых в молекулярно-генетической идентификации грибов, достаточно широк: гены, кодирующие рибосомальную РНК, - 18S rDNA, 5,8S rDNA, 28S rDNA; субъединицы РНК полимеразы II - rpb1, rpb2; фактор элонгации трансляции 1-альфа - tef1; митохондриальную АТФ-синтазу 6 - MT-atp6; бета-тубулин, актин и др. [7].

Цель настоящей работы - оценка возможного разнообразия представителей царства Fungi, выявленных у больных МВ, по данным литературы; выбрать мишень для идентификации возбудителей микозов непосредственно в тотальной ДНК, выделенной из образцов мокроты, отвечающую требованиям максимальной дифференцирующей способности в присутствии ДНК человека.

Биологические образцы и штаммы микроорганизмов. В работе использовали образцы мокроты больных МВ 1978-2009 гг. рождения. Штаммы возбудителей микозов от больных иными заболеваниями (не-МВ) выделяли преимущественно из образцов мокроты, а также из крови, мочи, отделяемого абсцесса, отделяемого при отите. Больные не-МВ в основном были представлены пациентами отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) ФГАУ ЛРЦ Минздрава России.

Культивирование и фенотипирование возбудителей микозов. К образцу мокроты добавляли равный объем 0,1% водного раствора дитиотреитола, перемешивали на вортексе в течение 15 с, готовили десятикратное разведение в триптиказо-соевом бульоне, аликвоту которого гомогенизировали с помощью стерильных стеклянных бус 20 мин при 37 °С при покачивании. 0,1 мл гомогената высевали на агар Сабуро и инкубировали до 7 сут при 37 °С. Определение дрожжей проводили с помощью наборов API strip и прибора mini API ("BioMérieux", Франция) или с помощью наборов КАНДИДАтест 21 ("Erba Lachema", Чешская Республика). Для идентификации мицеллярных грибов использовали зрелую спороносную культуру, которую определяли в микроскопическом исследовании согласно [8].

Выделение ДНК из образцов мокроты проводили согласно инструкции к набору реактивов The Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit на приборе Maxwell MDX Instrument ("Promega", США). Культуры микроорганизмов лизировали, как описано ранее [9].

Генотипирование возбудителей микозов. Для идентификации возбудителей микозов был выбран универсальный для всех таксонов царства грибов оперон рибосомальной РНК (рис. 1

Программы амплификации для трех мишеней отличались только температурой отжига праймеров: 95 °С - 3 мин; (95 °С - 30 с, 52/58/62 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин)×35; 72 °С - 5 мин.

Из схем MLST (MultiLocus Sequence Typing) C. albicans (http://calbicans.mlst.net/) и C. glabrata (http://cglabrata.mlst.net/) в анализ были взяты наиболее полиморфные мишени: VPS13, ZWF1 и FKS, NMT1 соответственно. По результатам анализа праймеры локусов ZWF1bF и FKSF1 были модифицированы с целью повышения специфичности. Использованные в исследовании праймеры представлены в табл. 3

Программа амплификации для мишеней C. albi­cans: 95 °С - 3 мин; (95 °С - 30 с, 55 - 30 с, 72 °С - 1 мин)×35; 72 °С - 5 мин. Для мишеней C. glabrata программа отличалась только температурой отжига, которая составила 62 °С.

Секвенирование продуктов ПЦР выполняли с праймерами для амплификации согласно протоколу к набору BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing kit на геномном анализаторе Genetic Analyzer 3130 ("Applied Biosystems/Hitachi", США). Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в капиллярах длиной 50 см с использованием полимера POP7.

Идентификацию секвенированных последовательностей проводили с применением геномной и программной базы BLAST.

Регистрация последовательностей. Последовательности фрагмента ITS1-5.8S-ITS2 оперона rDNA зарегистрировали в GenBank под номерами KT222006-KT222020, KT266850, KT345199 последовательности фрагмента гена 28S rDNA - под номерами KT222001-KT222005, KT345200.

Анализ данных литературы показал, что использование в лабораторной практике молекулярно-генетических методов, особенно метагеномного секвенирования образцов мокроты, а также расширение базы данных MALDI-TOF масс-спектрометров на основе результатов полногеномного секвенирования представителей царства Fungi, позволило существенно расширить перечень возбудителей микозов, выявленных у больных МВ.

Результаты анализа (табл. 4

При выборе мишени для идентификации всех выявленных возбудителей микозов мы опирались на следующие критерии: наиболее широкий спектр уже апробированных таксономических групп, представленность последовательностей в GenBank, отсутствие отжига праймеров на ДНК человека и бактерий, возможность дифференциации штаммов внутри вида. Таким образом, широкий спектр мишеней, представленный выше, мы сузили до трех.

Сравнение дифференцирующей способности трех мишеней в идентификации возбудителей микозов. Фрагменты оперона рибосомальной РНК, а именно: 1) участок гена 28S большой субъединицы рРНК (LSU), включающий наиболее вариабельные области D1-D2; 2) фрагмент, включающий внутренний транскрибируемый спейсер (Internal transcribed spacer) ITS1, ген 5.8S рРНК, ITS2; 3) только ITS2, были выбраны для дальнейшего изучения. Проверка, проведенная на штаммах C. albicans, C. glabrata, A. fumigatus, A. niger, A. flavus, выделенных от больных не-МВ, показала, что критерию максимальной дифференцирующей способности, в том числе в пределах вида, отвечает мишень №2. Например, штаммы C. albicans были отнесены к трем генотипам по этой мишени.

Мишень ITS1_5.8S_ITS2, прежде всего, отличает разнообразие размеров даже в пределах рода (табл. 5

В составе мишени наибольшим полиморфизмом отличался ITS1. При использовании мишени ITS1_5.8S_ITS2 на основе амплификации и секвенирования тотальной ДНК, выделенной из мокроты больных МВ, были идентифицированы следующие представители царства Fungi: C. albicans, C. dubliniensis, C. lusitaniae, Debaryomyces spp, Eurotium pseudoglaucus. Курьезная идентификация представителя семейства тыквенных Cucumis maderaspatanus у 3 пациентов с помощью указанных праймеров стала возможной в связи с высокой концентрацией ДНК этого растения в мокроте из-за приема пациентами препаратов, содержащих экстракт лекарственного растения.

MLST. Эпидемический анализ, как правило, требует более четкой дифференциации штаммов в пределах вида. С этой целью мы использовали наиболее вариабельные мишени MLST C. albicans и C. glabrata. При генотипировании C. albicans надежно себя зарекомендовали только праймеры мишени VPS13, что позволило различить образцы пациентов разных отделений ЛРЦ: одни содержали аллель 3, а другие аллель 20 данного локуса.

При изучении C. glabrata обе выбранные мишени (FKS и NMT1) показали воспроизводимые результаты. Для образца одного отделения ЛРЦ был получен профиль fks:5; nmt1:8, для двух образцов из другого отделения - fks:8; nmt1:3. Полученные данные были дополнены разнообразием мишени ITS1_5.8S_ITS2, по которой отличались все три образца.

Проверка мишеней MLST на образцах мокроты подтвердила возможность использования локусов при анализе тотальной ДНК.

Все разнообразие представителей царства Fungi у больных МВ при современном развитии технологий и баз данных можно типировать только с помощью амплификации и секвенирования фрагментов генома. Полному списку требований, предъявляемых к мишени, определяемой непосредственно в ДНК, выделенной из мокроты, отвечает фрагмент оперона рРНК - ITS1_5.8S_ITS2. Для ряда таксонов фрагмент ITS1_5.8S_ITS2 позволяет проводить дифференциацию штаммов внутри вида. Увеличение количества локусов генома в анализе приводит к повышению коэффициента дифференциации, однако такие локусы требуют тщательного отбора, проверки строгой специфичности, высокого полиморфизма, воспроизводимости результатов при работе с тотальной ДНК из образцов. Если для видов рода Candida исследование известных мишеней MLST позволяет сохранить в анализе отдельные из них после модификации праймеров, то для представителей других таксонов такой подход требует кропотливого перебора локусов, кандидатами которых могут быть и межгенные области. Тем не менее разработка схемы анализа, позволяющей различать штаммы грибов непосредственно в клиническом образце, необ­ходима для ускорения поиска источника инфекции.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования: работа профинансирована в рамках Государственного задания ФГБУ "ФНИИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России на 2015 г. и плановый период 2016 и 2017 гг.