Жевательные композиции как альтернативный способ взятия биологического материала при исследовании генома и ДНК вирусов человека

Для проведения молекулярно-генетических исследований, как правило, используются такие способы получения биологического материала, как венопункции для взятия образцов крови, получение соскобов буккального эпителия или образцов слюны. При этом для большинства молекулярно-генетических тестов в клинико-диагностических лабораториях исследование образцов крови по-прежнему остается единственным стандартизованным методом.

Ранее нами был предложен метод взятия биологического материала при помощи жевательных композиций на основе латексной жевательной резинки и серки лиственницы [1]. Метод основан на адсорбции клеток содержимого ротовой полости на жевательных композициях. При этом количество получаемого ДНК-содержащего материала зависит от свойств жевательной композиции, длительности контакта и особенностей клеточного состава слизистой полости рта. Кроме буккальных эпителиальных клеток на жевательную композицию могут адсорбироваться лейкоцитарные клетки, внеклеточные нуклеиновые кислоты и вирусные частицы.

Цель настоящей работы - демонстрация возможностей и подбор оптимальных условий использования жевательных композиций для исследования генетических полиморфизмов, выявления онкогенных соматических мутаций, а также для выявления ДНК вируса гепатита В.

В исследовании приняли участие 27 человек (добровольцы и пациенты), подписавшие информированное согласие и не имеющие на момент проведения исследования заболеваний ротовой полости.

На первом этапе работы для анализа генетических маркеров использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов цельной крови. Взятие крови с целью дальнейшего выделения ДНК осуществляли из локтевой вены утром натощак в вакутейнер с ЭДТА.

Для исследования полиморфизма C677Т (rs1801133) в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) были привлечены 16 добровольцев в возрасте от 19 до 52 лет. ДНК в данном случае выделяли из лейкоцитов цельной крови c использованием реагента ДНК-экспресс-кровь (НПО "Литех"), амплификацию и детекцию результатов проводили с использованием набора SNP-экспресс-РВ (НПО "Литех").

Для исследования 3 полиморфизмов спортивной предрасположенности: R577X C>T (rs1815739), K153R A>G (rs1805086) и P582S C>T (rs11549465) в генах, регулирующих развитие мышечных волокон - альфа-актинина 3 (ACTN3), миостатина (MSTN), фактора, индуцируемого гипоксией 1 альфа (HIF1A), соответственно были привлечены

3 спортсмена в возрасте от 19 до 21 года. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови в данном случае проводили с использованием набора ДНК-сорб-В (ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии"). Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора dsDNA HS Assay Kit на флуориметре Qubit ("Invitrogen", США) и готовили разведения ДНК в ТЕ-буфере. Полученную ДНК анализировали с использованием набора реагентов АмплиСенс Пироскрин, форма комплектации СПОРТ-мио-скрин (ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии") методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 ("Qiagen", Германия).

Для выявления и количественного анализа

соматической мутации V617F (rs77375493) в гене

яну­с­­киназы-2 (JAK2) были привлечены 4 чел овека с хроническим миелоидным неопластическим заболеванием в возрасте от 56 до 72 лет. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови в данном случае проводили аналогично вышеописанной методике при определении полиморфизмов спортивной предрасположенности. Полученную ДНК анализировали методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 ("Qiagen", Германия) с использованием набора реагентов АмплиСенс Пироскрин, Тромбо-скрин (ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии") в количественной модификации [2].

Для проведения исследований по обнаружению ДНК-содержащих вирусов были привлечены 4 взрослых пациента, находившиеся на диспансерном учете в КГБУЗ "Красноярский краевой Центр СПИД", у которых ранее был выявлен гепатит В. На момент проведения исследования данные пациенты имели положительные серологические маркеры гепатита В и определенную методом ПЦР-РВ вирусную нагрузку. Обнаружение вируса гепатита В проводили методом ПЦР с использованием набора реагентов ВгВ-FRT (ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии", Россия).

Далее, на втором этапе работы, для анализа вышеуказанных генетических маркеров использовали ДНК, выделенную из жевательных композиций. Для этого всем участникам исследования предлагали в качестве ДНК-сорбирующего материала использовать жевательные композиции как на натуральной (живица лиственницы сибирской, Larix sibirica), так и на синтетической (жевательная резинка Dirol) основах. Для выделения ДНК из используемых композиций был выбран сорбентный метод с использованием комплекта реагентов ДНК-сорб-В (ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии", Россия). При этом, учитывая тот факт, что консистенция данных композиций не позволяет использовать стандартный протокол выделения, нами была проведена модификация данного метода выделения ДНК. В частности, жевательные композиции на латексной основе предварительно нагревали при температуре 65 °С, затем растворяли в лизирующем растворе, центрифугировали и отделяли надосадочную жидкость. Далее все этапы выделения ДНК проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору: сорбция нуклеиновых кислот на сорбент, промывание и высушивание сорбента, на завершающей стадии - элюирование. Жевательные композиции на натуральной основе также предварительно нагревали при 65 °С и растворяли в 95% этаноле при постоянном перемешивании.

В полученный раствор добавляли лизирующий реагент и далее следовали стандартному протоколу выделения, прилагаемому к коммерческому набору. Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора dsDNA HS Assay Kit на флюориметре Qubit ("Invitrogen").

Полученные таким способом образцы ДНК использовали для дальнейшего анализа аналогично соответствующим методам тестирования ДНК, выделенной из венозной крови.

В ходе выполнения данной работы возможность использования жевательных композиций в качестве альтернативного способа неинвазивного взятия биоматериала с целью проведения молекулярно-генетических исследований продемонстрирована на нескольких примерах.

Пример 1. Использование жевательных композиций для выявления аллельных полиморфизмов в геноме человека.

В качестве первого примера нами был выбран полиморфизм гена MTGFR, исследование которого часто назначают пациентам для выявления наследственной предрасположенности к нарушению фолатного обмена и склонности к избыточному тромбообразованию. Для сорбции ДНК 8 из 16 человек использовали латексную композицию, а другие 8 - серку лиственницы сибирской. По результатам проведенных исследований было выявлено полное совпадение результатов генотипирования по гену MTGFR для всех 16 человек в соответствующих пробах ДНК, выделенных из лейкоцитов цельной крови, а также из жевательных композиций на основе латекса или серки лиственницы сибирской (табл. 1

Спортивная генетика - новое, динамично развивающееся направление, изучающее молекулярно-генетические механизмы развития физических способностей человека. Применение современных методов лабораторной диагностики позволяет выявить индивидуальные особенности организма с целью рационального подбора потенциально перспективных кандидатов и оптимизации тренировочного процесса, а также помочь в выборе вида спорта для детей. Поскольку анализ полиморфизмов спортивных генов актуален не столько взрослым, сколько начинающим спортсменам в младшем школьном возрасте, возникла потребность в поиске более удобного и безболезненного способа взятия биологического материала. Полученную из жевательной композиции ДНК исследовали с помощью метода пиросеквенирования, результаты приведены в табл. 2

Пример 2. Использование жевательных композиций для выявления онкогенной соматической мутации.

Известно, что развитие хронических миелоидных опухолей в большинстве случаев сопряжено с наличием соматической мутации V617F в гене JAK2 в клетках костного мозга, дифференцирующихся в миелоидном направлении. При этом мутация обнаруживается и в ДНК циркулирующих в крови гранулоцитов. Учитывая, что нейтрофилы являются одними из постоянных клеточных компонентов ротовой полости, мы предположили, что использование жевательных композиций позволит идентифицировать пациентов, имеющих данную мутацию. В табл. 3

ПЦР-РВ и количественного пиросеквенирования уровень аллельной нагрузки в образцах ДНК из лейкоцитов цельной крови.

Пример 3. Использование жевательных композиций для выявления ДНК-содержащих вирусов человека.

Хорошо известно, что вирус гепатита В присутствует во всех биологических жидкостях организма инфицированных пациентов. Поскольку в отличие от процедуры сбора слюны жевательные композиции более длительное время контактируют с вируссодержащей жидкостью, вероятность обнаружения вируса в составе композиции будет более высокой.

Для оценки возможности обнаружения в жевательных композиция ДНК вируса гепатита В были выбраны 4 пациента, обследованные в связи с постановкой диагноза вирусного гепатита В. Ранее у этих лиц было проведено исследование крови на серологические маркеры (HbsAg), качественная реакция на ДНК вируса гепатита В методом ПЦР и определена вирусная нагрузка в крови количественным методом ПЦР-РВ. Результаты выявления ДНК вируса гепатита В в пробах из жевательных композиций представлены в табл. 4

В результате проведенного исследования наличие вируса гепатита В в жевательных композициях было подтверждено у 3 из 4 обследуемых. Отрицательный результат соответствовал пациенту с уровнем вирусной нагрузки в крови менее 150 копий/мл, при этом у данного пациента уровень антигена вируса В (HBSAg), определяемый стандартным методом ИФА, также был ниже предела чувствительности тест-системы (0,05 мг/мл).

Таким образом, в настоящем исследовании показана возможность использования жевательных композиций в качестве оригинального способа неинвазивного взятия генетического материала как для исследования генетических полиморфизмов и соматических мутаций в геноме человека, так и для выявления ДНК-содержащих вирусов.

Раскрытие конфликта интересов: конфликт интересов отсутствует, авторы публикации не получали финансового вознаграждения и не являются сотрудниками учреждений, интересы которых могли бы влиять на достоверность представленных данных.

Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ СО РАН и СФУ.