Введение

Сибирская язва — особо опасная инфекция, вызываемая грамположительной бактерией Bacillus anthracis. Это заболевание поражает преимущественно копытных травоядных млекопитающих, но может передаваться человеку. По современным представлениям, этот вид возник относительно недавно [1]. К тому же B. anthracis образует эндоспоры, способные храниться в почве между циклами заражения годами, десятилетиями, и, возможно, столетиями [2, 3], что замедляет относительную скорость эволюции этого микроорганизма из-за снижения условного среднего количества циклов репликации генома в год. Высокая устойчивость и длительная сохранность жизнеспособности спор облегчают распространение патогена, в особенности антропогенное (при перевозке контаминированных продуктов животноводства).

В итоге B. anthracis, распространившийся за свою историю почти по всей планете, считался генетически довольно мономорфным видом. Однако были разработаны методы молекулярного типирования, позволяющие описать филогенетическую структуру этого вида с разной разрешающей силой. Один из таких методов — это canSNP-генотипирование, основанное на аллельном состоянии 14 «канонических» SNP (single nucleotide polymorphism — однонуклеотидный полиморфизм). На основе профиля этих SNP штаммы B. anthracis можно отнести к одной из 14 филогенетических групп, называемых canSNP-группы, объединенные в три основные эволюционные линии A, B и C [4, 5]. Штаммы линии C, представленной единственной canSNP-группой C.Br.001, крайне редки и обнаружены только в Северной Америке [5—7]. Линия A наиболее генетически разнообразна и объединяет canSNP-группы A.Br.008/009, A.Br.001/002, A.Br.Ames, A.Br.003/004, A.Br.005/006, A.Br.Aust94, A.Br.Vollum, и A.Br.WNA. Штаммы этих групп встречаются по всему миру с некоторыми географическими закономерностями [8]. Наиболее распространена canSNP-группа A.Br.008/009, также обозначаемая как TEA (Trans-Eurasian), штаммы которой циркулируют в Евразии и очень широко представлены в России, а также выявлены в Японии, США и Китае. Эта группа разделяется на две подгруппы: A.Br.008/011 и A.Br.011/009 [2, 9—11]. Группа A.Br.001/002 распространена в Китае, Таиланде, Индии, Индонезии, Вьетнаме, Казахстане, Австралии, Германии, Франции, Южной Африке, а также в России (Ямал), и др. [2, 5, 9, 12, 13]. От нее произошла группа A.Br.Ames, занесенная из Китая в США, и обнаруженная также в Японии, Монголии, Казахстане, Дании и России [2, 14—17]. Группа A.Br.WNA представлена в Северной и Южной Америках, Болгарии, Гаити [18, 19]. Группа A.Br.003/004 — Северной и Южной Америках, Германии, Финляндии и Южной Африке [2, 13, 20]. Группа A.Br.005/006 обнаруживается в Австралии, Центральной и Южной Африке, Дании, Великобритании, Корее [2, 13, 21, 22]. Группа A.Br.Aust94 распространена в Юго-Восточной Азии, Нидерландах, Индии, Австралии, Китае, Турции и Японии [23—26]. А группа A.Br.Vollum — в США, Европе и некоторых регионах Азии (Пакистан, Афганистан, Туркменистан, Таджикистан) [2, 9, 23].

Ареал распространения линии B и ее внутреннее генетическое разнообразие меньше. Эта линия включает три canSNP-группы: B.Br.CNEVA, распространенную в Центральной Европе, преимущественно в Альпийском регионе (Франция, Словакия, Швейцария, Австрия, Германия, Польша, Швеция) [5, 7, 15], B.Br.Kruger, встречающуюся в Южной Африке [5], и B.Br.001/002, штаммы которой, как считалось до недавнего времени, встречаются в Южной Африке, Европе и Корее [5, 20, 21]. Но за последние 10 лет обнаружено, что ареал распространения линии B гораздо шире. Вначале оказалось, что вспышка сибирской язвы на Ямале в 2016 г. была вызвана штаммом группы B.Br.001/002. Затем мы обнаружили в вечной мерзлоте Якутии штамм, генетически крайне схожий с ямальским штаммом [2] (назовем их арктическими штаммами). Затем С.В. Писаренко и соавт. опубликовали данные о еще более широком распространении группы B.Br.001/002 в Сибири [27]. И, наконец, штамм, крайне схожий с арктическими штаммами B.Br.001/002, выделен на Севере Казахстана (в Южной Сибири) [15, 16]. Таким образом, группа B.Br.001/002 оказалась эндемичной для Центральной Евразии, и ареал ее распространения простирается не менее, чем на 2000 км с севера на юг и с запада на восток.

CanSNP-типирование — не единственный метод генотипирования сибиреязвенного микроба. Недавно в отношении B. anthracis нами [9, 28] и сотрудниками ФКУЗ Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора [29] был применен метод MVLST (Multi Virulence Locus Sequence Typing), основанный на анализе аллельного полиморфизма генов факторов патогенности. Такими факторами, обусловливающими патогенный потенциал B. anthracis, и приобретение которых стало главным эволюционным событием, выделившим его как отдельный вид, являются сибиреязвенный токсин и капсула. Синтез этих факторов кодируют гены, расположенные на двух плазмидах вирулентности — рХО1 и рХО2 [30]. На рХО2 локализован оперон capBCADE, кодирующий ферменты синтеза капсулы, состоящей из поли-γ-D-глутаминовой кислоты. Капсула покрывает поверхность вегетативной клетки B. anthracis, защищая ее от иммунных реакций хозяина [31, 32]. На рХО1 расположены гены, кодирующие сибиреязвенный токсин, состоящий из трех компонентов: протективного антигена (PA — protective antigen), летального фактора (LF — lethal factor) и отечного фактора (EF — edema factor). PA является порообразующим белком, формирующим комплексы с LF или EF, называемые соответственно летальным токсином (LT) и отечным токсином (ET), и обеспечивает проникновение эффекторных LF и EF в цитозоль клеток млекопитающих [33]. LF — это цинк-зависимая металлопротеаза, специфичная в отношении митоген-активируемых киназ клетки хозяина, расщепляя которые она нарушает сигнальные пути этих клеток [34, 35]. EF — кальмодулин-зависимая аденилатциклаза, также нарушающая сигнальные пути клеток за счет увеличения уровня синтеза циклического аденозинмонофосфата. Клинически действие EF проявляется как отек тканей, что послужило основанием для его названия [33]. Совокупное действие этих белков приводит к гибели клеток хозяина, поражениям тканей и органов, и в итоге к смерти.

Проведенный нами в предыдущей работе [9] MVLST-анализ, помимо прочего, показал, что сибирские штаммы группы B.Br.001/002 обладают тем же MVLST_pXO1-генотипом, что и штамм B. anthracis 44 — единственный на тот момент штамм группы B.Br.CNEVA в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ-Оболенск (Оболенск, Россия). Это дало нам основания предположить эволюционную связь групп B.Br.CNEVA и B.Br.001/002 через штамм 44 и сибирские штаммы. В данной статье мы подтверждаем и расширяем наши выводы путем MVLST-анализа геномов репрезентативной выборки штаммов B. anthracis эволюционной линии B, основанного на последовательностях генов главных факторов патогенности плазмид рХО1 и рХО2.

Цель данной работы заключалась в сравнительном wgSNP- и MVLST-анализе репрезентативной выборки штаммов B. anthracis эволюционной линии B.

Материал и методы

Штаммы. В работе исследованы 55 штаммов B. anthracis различного географического происхождения (табл. 1). Семь штаммов депонированы в ГКПМ-Оболенск (Оболенск, Россия), геномы других 48 штаммов получены из базы данных GenBank. Для всех исследуемых штаммов известна canSNP-группа.

Таблица 1. Перечень исследуемых штаммов и регионов их выделения

Примечание: 1 * Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ-Оболенск (Оболенск, Россия); 2 ** Номер доступа к последовательности генома или архиву с результатами полногеномного секвенирования в базе данных GenBank; 3 *** Н/Д — нет данных.

Полногеномное секвенирование. Для культивирования штаммов использовали BHI агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Тотальную геномную ДНК выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific», США). Стерильность образцов ДНК подтверждали культивированием 5% конечного объема ДНК с отрицательными результатами. Концентрацию ДНК определяли количественно с использованием спектрофотометра NanoDrop One («Thermo Fisher Scientific», США). Полногеномное секвенирование проводили на платформе DNBSEQ-G400 («MGI Tech», Китай). Для приготовления ДНК-библиотек использовали набор MGIEasy Universal DNA Library Prep Set («MGI Tech», Китай). Фрагментацию осуществляли в системе ультразвуковой фрагментации ДНК BioRuptor («Diagenode», США). Запуск NGS-секвенатора осуществляли с использованием набора DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set (2 × 150 bp) («MGI Tech», Китай) согласно инструкциям производителя.

MVLST-анализ проводили по схеме, описанной в [9, 28]. Сборки нуклеотидных последовательностей геномов по результатам полногеномного секвенирования осуществляли с использованием программного пакета UGENE («Унипро», Россия) [36]. В качестве референсного генома, на последовательность которого осуществляли сборку, использовали геном штамма B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: GCA_000008445.1). Для MVLST-анализа использовали слитые in silico последовательности генов по схемам MVLSTpXO1 и MVLSTpXO2 по отдельности и по обеим схемам одновременно. Номера сиквенс-типов (ST) и генотипов (GT) присваивали согласно работам [9, 28]. В случае выявления новых ST и GT, их номера были присвоены по порядку в соответствии с теми же работами. Множественные выравнивания осуществляли с помощью программного пакета MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net). Филогенетический анализ проводили с помощью программного пакета PHYLOViZ 2.0 [37]. Для идентификации коровых SNP при проведении wgSNP-анализа использовался Snippy v. 4.6.0 [38]. В качестве референсного использовали геном штамма B. anthracis HYU01 (GenBank: GCA_000725325.1). Визуализация филогенетического дерева была выполнена с помощью SplitsTree4 v. 4.19.2 с использованием метода Neighbor Joining [39].

Результаты и обсуждение

Наибольший интерес в данной работе представляют штаммы, выделенные на территории РФ и СССР. На момент выполнения работы мы располагали семью штаммами B. anthracis линии B, два из которых выделены в Литве и относились к canSNP-группе B.Br.CNEVA, а остальные пять выделены в Сибири и отнесены к canSNP-группе B.Br.001/002. Эту панель штаммов мы дополнили представительной выборкой геномов штаммов линии B различного географического происхождения, депонированных в GenBank (см. табл. 1).

В ходе MVLST-анализа отобранных штаммов мы обнаружили не только описанные нами в ранее опубликованных работах [9, 28] сиквенс-типы (аллели отдельных генов) и генотипы (комбинации аллелей генов патогенности), но и ряд новых. Так у штамма A0091, выделенного в ЮАР, мы обнаружили новую аллель гена lef, обозначенную как lef-ST10, и отличающуюся от последовательности этого гена референсного штамма тремя SNP: 895G→A, 2017G→C, 2126A→G. MVLST_pXO1-генотип, включающий эту аллель, был обозначен MVLST_pXO1GT21. У этого же штамма обнаружена ранее не описанная аллель гена capB — capB-ST5 (1281A→G), на основании чего его MVLST_pXO2-генотип обозначен MVLSTpXO2GT19. У двух штаммов швейцарского происхождения JF3854 и JF3852 нами обнаружена новая аллель pagA-ST12, несущая мутации 195C→T, 1799C→T, 2244C→A. Их MVLST_pXO1-генотип обозначен MVLST_pXO1GT22. У штамма 2002013147, выделенного в Арканзасе, мы выявили аллель capB-ST4 (367G→A), генотип обозначен как MVLST_pXO2GT17; у штамма 2002734047 (Нью-Джерси) — аллели capA-ST6 (788C→G) и acpA-ST5 (180A→G, 853G→A, 4 тандемных повтора ATA**GATA), MVLST_pXO2GT18; у австрийского штамма Tyrol 3520 — аллель capA-ST7 (101C→T), MVLST_pXO2GT20. Все выявленные в работе MVLSTpXO1- и MVLST_pXO2- генотипы и мутации, характерные для них, представлены в табл. 2.

Таблица 2. Выявленные MVLST-генотипы и характерные для них нуклеотидные замены

Филогенетическое дерево, построенное по коровым SNP при wgSNP-анализе геномов исследуемой выборки, включающих хромосому и обе плазмиды, приведено на рис. 1 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_016_add.zip). На этом дереве отмечены также MVLST-генотип штаммов или кластеры штаммов, их canSNP-группы и страны, на территории которых штаммы были выделены. На рис. 1 и далее по тексту MVLST-генотип указан в формате «номер MVLST_pXO1-генотипа / номер MVLST_pXO2-генотипа».

Из данных рис. 1 следует, что группа B.Br.001/002 разделяется на две группы кластеров штаммов. Одна из них представлена штаммами, выделенными в России, Казахстане, Эстонии, Финляндии и Корее, и расположена близко к штаммам группы B.Br.CNEVA. Дистанция между центральным штаммом этого клонального комплекса (BA2968), определенного с помощью PHYLOViZ2.0 методом goeBURST, и ближайшим штаммом группы B.Br.CNEVA (JF3887) составляет 105 SNP. Вторая группа объединяет штаммы B.Br.001/002 из США, Африки, Бутана и Швеции и группу B.Br.Kruger (ЮАР). Центральный штамм этого клонального комплекса (SVA11) отделен от штамма BA2968 дистанцией в 211 SNP — максимальной дистанцией в исследуемой выборке. Таким образом, генетическая дистанция между двумя описанными клональными комплексами группы B.Br.001/002 оказалась в два раза больше, чем дистанция между штаммами Российского, Казахского и Финского происхождения и группой B.Br.CNEVA.

Группа B.Br.CNEVA также подразделяется на два основных кластера. Один из них, наиболее многочисленный, представлен штаммами из стран Альпийского региона — Франции, Швейцарии, Германии и Австрии. Второй сформирован штаммами из Литвы, Польши, Словакии, Италии и Швейцарии. Минимальная дистанция между штаммами, связующими эти клональные комплексы, — JF3887 и ANSES017 — составляет 50 SNP.

Распределение исследуемой выборки штаммов по MVLST-генотипам в целом соответствует их кластеризации по коровым SNP (см. рис. 1). На рис. 2 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_017_add.zip) мы отобразили филогенетические отношения MVLST-генотипов линии B B. anthracis, показав их связь с линией A через референсный штамм Ames Ancestor. Центральную позицию среди линии B занимает GT5/9, обладающий минимальным набором мутаций в генах патогенности, характерным для всех штаммов линии B. Остальные генотипы обладают дополнительными мутациями, по мере накопления которых отдаляются от GT5/9. GT5/9 включает штаммы B.Br.CNEVA, выделенные за пределами «типичного» ареала распространения этой группы — в Польше, Литве, Словакии и Италии. Большая часть штаммов группы B.Br.CNEVA выделены в Швейцарии, Германии, Австрии и Франции, отнесены к GT5/2 и отличаются от центрального генотипа мутацией capD 234T→C. От этой группы отходит генотип, представленный единственным на данный момент штаммом Tyrol 3520, выделенным в Австрии, который отличается наличием мутации capA 101C→T (GT5/20). Вторая, минорная линия группы B.Br.CNEVA, представлена двумя швейцарскими штаммами JF3852 и JF3854, которые отличаются от центрального генотипа мутацией pagA 2244C→A и формируют ранее не описанный генотип GT22/9.

Остальные штаммы относятся к группам B.Br.001/002 и B.Br.Kruger и связаны с центральным GT5/9 через GT5/4, обладающим дополнительной мутацией capA 1033A→G. Этот генотип представлен преимущественно сибирскими штаммами, выделенными в Заполярье и Южной Сибири, и одним финским штаммом, который на дендрограмме, построенной по коровым SNP, расположен на наименьшей дистанции от группы B.Br.CNEVA среди всех штаммов B.Br.001/002. Мутация capA 1033A→G также представлена у штаммов группы B.Br.001/002, выделенных в европейской части России и Грузии [17, 29]. От GT5/4 отходят две ветви, одна из которых через GT9/4, приобретшая мутацию pagA 1297A→G и представленная штаммами из Сибири (I-364, Бурятия) и Южной Кореи (HYU01), ведет к GT9/14, обособленному еще двумя мутациями capD 1120T→ C и 1183A→G и представленному эстонским штаммом 157(B-1107). Вторая ветвь, состоящая из нескольких политомий включает пять генотипов группы B.Br.001/002 африканского, американского, шведского и бутанского происхождения и один генотип группы B.Br.Kruger.

Таким образом, несмотря на сокращение длины анализируемой последовательности с ~ 5,5 млн п.о. (размер генома) до 16,2 тыс. п.о. (размер слитой последовательности генов патогенности) и соответствующее сокращение ветвей дендрограммы, выраженное в сокращении дистанции между максимально удаленными друг от друга штаммами с 406 до семи SNP, общая топология дендрограмм остается схожей. Это подтверждает сонаправленность эволюции комплекса генов факторов патогенности с эволюцией генома в целом, и эта тенденция уже была отмечена другими исследователями, хотя их выводы были сделаны не на основе анализа последовательностей генов патогенности, а на основе сравнения кластеризции штаммов при анализе хромосомных и плазмидных SNP [40, 41]. Мы же при разработке схемы MVLST для B. anthracis исходили из тезиса о том, что эволюционные тенденции всего репликона могут отличаться от направления эволюции отдельных групп функциональных генов, находящихся под действием стабилизирующего или движущего отбора. Хотя мы не обнаружили таких фактов в отношении выбранного нами комплекса генов, MVLST-типирование позволило идентифицировать небольшой набор генетических маркеров, позволяющих определить филогенетическое положение штамма и регион его вероятного происхождения. Это важно при проведении эпидрасследований во время вспышек сибирской язвы или выявлении контаминированного B. anthracis материала, когда требуется в сжатые сроки не только идентифицировать патоген, но и определить, является выделенный штамм эндемичным или завезенным из другого региона. В большинстве случаев для решения этой задачи в первом приближении достаточно выявления одного или нескольких описанных нами в предыдущих исследованиях и этой работе MVLST-маркеров.

Оговорка насчет необходимости учета нескольких маркеров не случайна, так как именно среди штаммов линии В обнаруживаются маркеры, общие для достаточно отдаленных филогенетических групп [9]. Например, аллель pagA 1799С, выявленная у ветви, объединяющей штаммы групп B.Br.Kruger и B.Br.001/002 африканского происхождения (а также один шведский и один американский штамм), характерна также для части штаммов линии А, а именно групп A.Br.Ames, A.Br.001/002 и A.Br.Austr94. Эти три группы генетически относительно близки и формируют на глобальной дендрограмме B. anthracis отдельный кластер, не связанный напрямую с линией В [5]. Аллель pagA 1799C распространена не только среди всех остальных филогенетических групп B. anthracis, включая линию C, но и у близкородственных микроорганизмов B. cereus, обладающих pXO-подобными плазмидами [1, 42, 43]. Учитывая структуру глобального филогенетического дерева B. anthracis [5], мы считаем маловероятными сценарии, по которым аллель с этой SNP могла распространиться в этих группах от общего предка, и считаем более вероятным, что изменение аллельного состояния происходило в них независимо. Учитывая, что эта SNP несинонимична, и замена pagA 1799С→Т приводит к аминокислотной замене A→V в III домене белка PA, мы, с крайней степенью осторожности, можем предположить, что эта мутация, влияя на функциональную активность белка, влияет неким образом на приспособленность и выживаемость B. anthracis.

Глобальная филогения B. anthracis, основанная на анализе wgSNP, демонстрирует наличие небольшого числа замечательных топологических особенностей, звездообразных узоров, называемых политомиями. Полногеномное секвенирование панели изолятов, выделенных во время одной вспышки сибирской язвы показывает, что в каждом случае виден типичный звездообразный паттерн, состоящий из штаммов, отличающихся обычно одним SNP от генотипа-предшественника в центре политомии. Политомия, по-видимому, является систематическим результатом вспышек, но она редко сохраняется в долгосрочной перспективе. Для сохранения образованного генотипа и его эволюционного расхождения с предковым требуется перенос нового штамма в новую экосистему, населенную восприимчивыми к заболеванию животными [41].

Для эволюции B. anthracis и его распространения по миру ключевое значение имеют круг хозяев и способность образовывать эндоспоры. Сибирская язва — это зооноз, поражающий преимущественно травоядных копытных, которые зачастую ведут стадный образ жизни, причем размер стад может достигать десятки тысяч особей. Такая численность популяции значительно облегчает распространение инфекций, а способность к спорообразованию обусловливает сибиреязвенному микробу преимущество, так как распространение заболевания не требует прямого контакта между особями, и споры, сохраняясь в почве на месте гибели животного, могут вызвать новую вспышку болезни спустя многие годы. Начиная с неолитической революции и до новейшего времени, когда возникла система санитарного контроля, роль в распространении сибирской язвы начал играть антропогенный фактор. Копытные составляют основу сельского хозяйства, а до недавних пор были единственным сухопутным транспортом. Кроме того, продукты животноводства, такие как соленое/копченое/вяленое мясо, шерсть, кожа, рога и т.д., повсеместно использовались для употребления в пищу, изготовления предметов обихода, одежды, военного снаряжения. Следовательно, любые переселения, колонизация новых территорий, торговые экспедиции и военные походы неминуемо сопровождались перемещением больших масс животных и/или продуктов животноводства, которые могли быть контаминированы спорами B. anthracis. Это обстоятельство создает условия переноса B. anthracis через области, в которых естественный перенос невозможен.

Реконструкция картины распределения штаммов и эволюции вида B. anthracis в итоге оказывается крайне непростой задачей. Путем природного и антропогенного переноса генетически родственные штаммы могут оказаться занесенными в далеко расположенные друг от друга регионы, где их дальнейшая эволюция может проходить по-разному. При этом могут накапливаться мутации, в том числе в генах вирулентности, по которым такие локальные популяции отличаются друг от друга. Одновременно в одну и ту же область могут раз за разом заноситься штаммы из разных источников — в итоге локальные популяции сибиреязвенного микроба могут быть представлены штаммами различных генетических линий. Поэтому само по себе географическое происхождение штамма B. anthracis малоинформативно и должно рассматриваться обязательно в связке с его генетическим профилем.

В данной работе мы сконцентрировали усилия на штаммах эволюционной линии B, применив для их генотипирования и филогеографического анализа, помимо wgSNP-типирования, метод MVLST. Кроме прикладной задачи определения генетических маркеров, указывающих на филогеографическое положение штамма, метод MVLST подчеркнул относительную генетическую близость двух подгрупп: «восточно-европейской» подгруппы B.Br.CNEVA и «северо-евразийской» подгруппы B.Br.001/002. Обе эти подгруппы объединяет то, что они распространены частично за пределами «классических» ареалов групп B.Br.CNEVA и B.Br.001/002, а также сравнительно низкое генетическое разнообразие внутри подгруппы, несмотря на огромную протяженность ареалов и наличие внутри них масштабных географических преград, препятствующих естественной миграции штаммов. Например, область выделения штаммов «восточно-европейского» кластера B.Br.CNEVA простирается относительно узкой полосой от Балтики до Адриатики в меридиональном направлении и разделена Альпами. Область распространения штаммов «северо-евразийской» подгруппы B.Br.001/002 простирается от Скандинавии до Кореи и от Казахстана до Арктики. Кроме того, по данным Е.Еременко и соавт., в «северо-евразийскую» подгруппу, наряду с сибирскими и финским штаммом, входят штаммы, выделенные на Северном Кавказе, в Татарстане, Башкортостане и Тверской области [17]. При этом наиболее удаленными между собой в рамках этой огромной территории являются точки выделения сибирского кластера штаммов, представленного MVLST-GT5/4. Ареал распространения этой подгруппы разделен в меридианальном направлении Уральским хребтом, а в широтном — зоной лесов.

Как мы упоминали, сибирская язва поражает травоядных копытных, поэтому для ее распространения по планете требуются протяженные пространства, на которых обитают крупные популяции диких или одомашненных копытных. Во временном промежутке 20 тыс. лет назад (наиболее часто встречающаяся временная граница возникновения вида B. anthracis [1]) такими крупными экосистемами в Евразии были: 1) Тундростепь, она же Мамонтовая степь, 2) Великая степь, она же Евразийская степь, 3) Арктическая тундра. Эти широтно-протяженные зоны населены или были населены большими популяциями восприимчивых к сибирской язве животных, будь то сайгаки, дикие лошади, овцебыки, мамонты и другая мегафауна, или северные олени. Все три региона связаны исторически. С эпохи плейстоцена и до последнего ледникового максимума Великая степь была частью Тундростепи, которая охватывала территорию от современной Испании до Канады (включая Берингию). По мере отступления ледника зона Тундростепи сместилась на север и деградировала в современную тундру, которая отрезана от Великой степи зоной лесов. Но в этих экосистемах могли остаться генетически родственные штаммы B. anthracis, ареал циркуляции которых оказался разделенным лесом на северную (тундровую) и южную (степную) части. Зона лесов поглотила Европу и только в исторически недавнее время была замещена агроценозами. Однако это объяснение сдвигает временные рамки распространения группы B далеко в прошлое и не учитывает антропогенный фактор в распространении B. anthracis по планете.

Что касается северо-евразийских штаммов B.Br.001/002, то антропогенными векторами их переноса могут быть системы рек Оби, Енисея и Лены с их притоками, которые текут с юга, из лесостепной зоны на север, через тайгу и тундру, и впадают в Северный Ледовитый океан. В условиях отсутствия дорожной сети реки издавна используются в качестве транспортных маршрутов как в теплый период года для хождения на судах, так и зимой, как санный путь. Вдоль этих рек могли проходить маршруты торговых и грабительских операций, целью которых были меха и моржовая кость, добываемые на севере и высоко ценимые в государствах Европы и Ближнего Востока. Кроме того, по этим маршрутам могли проходить минорные миграции больших групп людей (и сопровождающих их животных), покинувших свои кочевья из-за завоеваний и расселений крупных кочевых этносов в Великой степи, таких как гунны и монголы. При этом миграция могла осуществляться не только с востока на запад, но и с юга на север вдоль русел сибирских рек. Начиная с XVI в. по мере русского покорения Сибири роль таких речных маршрутов в обеспечении транспортной связи континента и распространения штаммов патогенных микроорганизмов, в том числе и B. anthracis, значительно выросла, и выросла вероятность переноса штаммов между степной и тундровой зоной.

Учитывая, что: 1) низкая продуктивность арктических экосистем обусловливает низкую численность восприимчивых к сибирской язве животных и вынуждает их находиться в постоянных миграциях; 2) климатические условия в течении большей части года препятствуют заражению сибирской язвой (из-за нарушения спорообразования после гибели животного при отрицательных температурах и невозможности пасущимися животными вырывать растения с корнями и потенциально контаминированной почвой из промерзшего грунта), скорость эволюции вида B. anthracis в Арктике должна быть сравнительно небольшой. Следовательно, арктические штаммы должны быть эволюционно близки с предковым генотипом линии B, от которого произошли группы B.Br.CNEVA и B.Br.001/002. Близость к этому же предковому генотипу восточно-европейских штаммов выглядит довольно интригующе. Для объяснения этого феномена мы можем принять во внимание несколько факторов. Во-первых, географический фактор: Литва и Польша наиболее приближены к ареалу распространения сибирских штаммов B.Br.001/002. Во-вторых, исторический фактор: прибалтийский регион несколько веков был ареной противостояния русских княжеств, а впоследствии Российского царства (использующих союзные контингенты конных степняков — татар) с Литвой, Польшей, а также скандинавскими государствами и немецкими рыцарскими орденами. Перемещения конных воинских контингентов могло создать условия для переноса штаммов B. anthracis между Польско-Литовским регионом и северо-восточной Россией, а также степной зоной. И, в-третьих, сохранности предковых генетических черт у восточно-европейских штаммов могла способствовать потенциально более низкая скорость эволюции B. anthracis в этом регионе по сравнению со странами Альпийского региона, в которых циркулирует группа B.Br.CNEVA, и где географические и климатические условия издавна способствуют развитию крупностадного скотоводства. Это в свою очередь создает благоприятные условия для циркулирования возбудителя сибирской язвы, его эволюции и накопления дополнительных мутаций, отдаляющих современные штаммы от предкового генотипа.

Заключение

Исследование филогеографической структуры эволюционной линии B B. anthracis путем анализа геномов штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, СССР и других государств, методами wgSNP- и MVLST-генотипирования выявило генетическое родство северо-евразийских штаммов группы B.Br.001/002 с восточно-европейским кластером штаммов группы B.Br.CNEVA и показадо эволюционную связь этих двух групп с гипотетическим предковым генотипом B. anthracis линии B. В результате MVLST-типирования выявлены описанные нами в предшествующих работах и новые сиквенс-типы и генотипы, а также генетические маркеры, позволяющих установить филогенетическое положение и вероятный регион происхождения штаммов.

Финансирование работы. Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.