Карпова Т.И.

ФГБУ «ФНИИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18

Тартаковский И.С.

ФГБУ «ФНИИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18

Лабораторная диагностика легионеллезной инфекции

Журнал: Лабораторная служба. 2015;4(1): 30-34

Просмотров : 256

Загрузок : 2

Как цитировать

Карпова Т. И., Тартаковский И. С. Лабораторная диагностика легионеллезной инфекции. Лабораторная служба. 2015;4(1):30-34. https://doi.org/10.17116/labs20154130-34

Авторы:

Карпова Т.И.

ФГБУ «ФНИИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18

Все авторы (2)

В последние годы получено много новых данных в области биологии и экологии легионелл, разработаны и активно применяются методы молекулярно-генетического типирования, позволяющие выявлять эпидемически значимые клоны возбудителя при расследовании эпидемических вспышек легионеллезной инфекции. Своевременное применение методов экспресс-диагностики (прежде всего, доступного и простого метода определения легионеллезного антигена в моче иммунохроматографическим методом) привело к росту числа выявляемых случаев инфекции как в высокоразвитых индустриальных, так и в развивающихся странах. Легионелла — убиквитарный водный микроорганизм, требующий выполнения целого ряда условий для проявления своих патогенных свойств и создания реальной угрозы здоровью человеку. Парадокс состоит в том, что сам человек и создал эти условия для вполне безобидного микроорганизма, паразитирующего в водных простейших, сконструировав соответствующие водные системы в интересах современной цивилизации. Методология мониторинга легионелл в потенциально опасных водных системах, основанная на сочетании бактериологии и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, внедряется в практику эпиднадзора, в том числе в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ). Вместе с тем микробиологическая диагностика легионеллезной инфекции у больных пневмониями, несмотря на наличие национальных стандартов лабораторной диагностики легионеллеза, рекомендованных целым рядом документов, и успешный опыт применения этих стандартов во время крупной эпидемической вспышки легионеллезной инфекции в Верхней Пышме, не всегда активно и своевременно применяется в бактериологических лабораториях ЛПУ. Во многом такое отношение объясняется объективным фактором необходимости определенных затрат на внедрение новой методологии и субъективным фактором недооценки реальной роли возбудителя в этиологии пневмоний в Российской Федерации. Известно, что легионеллез не является природно-очаговым заболеванием, частота заболеваемости зависит от уровня контаминации легионеллами потенциально опасных водных систем (прежде всего, систем горячего водоснабжения и водных систем охлаждения общественных зданий и промышленных предприятий), с которыми соприкасается пациент группы риска. Полученные нами данные в 2010—2013 гг. свидетельствуют о высоком уровне контаминации легионеллами потенциально опасных водных систем на территории России, в том числе в зданиях ЛПУ [1, 2]. Число выявленных случаев легионеллеза при соответствующем уровне контаминации объектов окружающей среды зависит от широты применения современных стандартов лабораторной диагностики легионеллеза для больных тяжелыми пневмониями, как внебольничными, так и нозокомиальными. Так, введение обязательного применения метода определения легионеллезного антигена в моче для пациентов групп риска привело к 3-кратному увеличению числа выявляемых случаев легионеллезной пневмонии в США с 2001 по 2009 г. (с 1000 до 3500 случаев в год). Количество ежегодно выявляемых случаев легионеллеза в США в настоящее время сравнимо с числом случаев острой формы гепатита В, значительно превосходит острый гепатит С, не уступая этим социально значимым заболеваниям по проценту летальных исходов [3, 4].

В качестве диагностических критериев легионеллезной пневмонии действуют международные, а с 2010 г. и национальные стандарты, в соответствии с которыми диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной) считается установленным: а) при выделении культуры легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани; б) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к Legionella pneumophila серогруппы 1 в реакции непрямой иммунофлюоресценции; в) при определении растворимого антигена Legionella pneumophila серогруппы 1 в моче иммуноферментным или иммунохроматографическим методом.

При отсутствии сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление достоверно высокого уровня антител к Legionella pneumophila серогруппы 1 (1:128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Аналогичным образом интерпретируются результаты, полученные на основании выявления возбудителя или его ДНК в респираторном секрете или легочной ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

С 80-х годов прошлого века в отечественной практике диагностики легионеллеза основным методом являлась непрямая иммунофлюоресценция. Причем доступной часто могла быть лишь одиночная сыворотка, что позволяло установить предполагаемый диагноз. При наличии даже парных сывороток диагноз носил запоздалый ретроспективный характер (4-кратное нарастание титров антител занимает около 3 нед) и не позволял скорректировать схему антибиотикотерапии тяжелой пневмонии легионеллезной этиологии. Техника взятия материала для бактериологического исследования (БАЛ, биопсия) и сейчас далеко не всегда доступна при обследовании больных тяжелыми пневмониями. Этим и объясняется, почему до начала настоящих исследований культуру легионелл удавалось выделить только из секционного материала.

В качестве базового метода диагностики легионеллеза в нашей стране выбран иммунохроматографический метод. По данным ВОЗ, в почти 90% случаев легионеллеза в мире первичный диагноз внебольничной легионеллезной пневмонии устанавливается по определению антигена легионелл в моче. В случае острой тяжелой пневмонии диагностику легионеллеза иммунохроматографическим методом можно осуществить непосредственно в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) в течение 30—40 мин, так как методика не требует специального оборудования.

Вместе с тем, используемые в настоящее время иммунохроматографические и иммуноферментные тест-системы позволяют выявить в моче лишь антиген L. pneumophila серогруппы 1, что значительно сужает возможности лабораторной диагностики в отделениях групп риска ЛПУ. В ОРИТ в гематологических, онкологических центрах, центрах трансплантации органов на фоне иммуносупрессивной терапии инфекцию часто вызывают штаммы других серогрупп и видов Legionella spp. [1].

С декабря 2010 г. по январь 2014 г. диагностику легионеллеза осуществляли у 76 пациентов с заболеваниями системы крови, поступивших в ОРИТ ФГБУ «Гематологический научный центр» в связи с развитием у них острой дыхательной недостаточности вследствие двусторонней пневмонии.

Всех больных обследовали в соответствии со схемой, представленной на рис. 1, предусматривающей выполнение фибробронхоскопии БАЛ с последующим высевом жидкости БАЛ на селективные для легионелл среды, а также определение антигена легионелл в моче больных иммунохроматографическим методом. Однако у иммунокомпрометированных больных серьезную опасность могут представлять также L. pneumophila других серогрупп. Выделение культуры в жидкости БАЛ бактериологическим методом занимало не менее 4—5 сут, вследствие этого нередко диагноз легионеллеза устанавливался слишком поздно и этиотропную терапию не успевали назначить. Экспресс-диагностика легионеллеза, основанная на определении легионеллезного антигена в моче иммуноферментным или иммунохроматографическим методом, была невозможна у пациентов с острой или хронической почечной недостаточностью, которым проводился гемодиализ и, как следствие, наблюдалась олигоанурия.

Рис. 1. Схема исследования клинического материала от больных с подозрением на легионеллезную пневмонию.

В подобных случаях наиболее приемлемым решением может служить использование ПЦР.

ПЦР проводили в референс-центре по мониторингу за возбудителями инфекций верхних и нижних дыхательных путей ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора с использованием набора реагентов [5] производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). Мишенью для обнаружения ДНК L. pneumophila в данном тесте является ген mip, кодирующий протеин, являющийся фактором вирулентности, необходимым для внутриклеточной инвазии в макрофаги, присутствующий в геноме L. pneumophila всех серогрупп. Метод выявления ДНК L. pneumophila в клиническом материале основан на одновременной амплификации участка ДНК гена mip L. pneumophila и участка генома человека (эндогенный внутренний контроль). Результат амплификации ДНК L. pneumophila регистрируется при измерении флюоресценции красителя JOE, результат амплификации ДНК внутреннего контроля регистрируется при измерении флюоресценции красителя FAM. Эндогенный внутренний контроль позволяет не только контролировать этапы ПЦР-анализа (экстракция ДНК и проведение ПЦР), но и оценивать адекватность забора материала, что необходимо, так как искомый возбудитель является внутриклеточным патогеном (рис. 2) [5].

Рис. 2. Схема исследования клинического материала больных с подозрением на легионеллезную пневмонию, находящихся на гемодиализе (с олигоанурией).

Диагноз легионеллезной инфекции был подтвержден у 8 (10,5%) из 76 больных. У 7 больных диагноз был подтвержден выделением культуры Legionella pneumophila в БАЛ. В 3 случаях выделены культуры серогруппы 1, в 3 — серогруппы 3, в 1 — серогруппы 9. Бактериологический анализ образцов воды из системы горячего водоснабжения ЛПУ показал наличие в ней штаммов L. pneumophila серогрупп 2 и 3. Штаммы L. pneumophila серогруппы 1 в воде отсутствовали. Для сравнительной характеристики клинических штаммов легионелл и штаммов, циркулирующих в системе водоснабжения ЛПУ, использовали дрезденскую панель моноклональных антител и мультилокусное секвенирование в соответствии с SBT-протоколом ELDSNet [2]. Мультилокусное секвенирование подтвердило идентичность штамма L. pneumophila серогруппы 3, циркулирующего в системе водоснабжения, и штаммов L. pneumophila серогруппы 3, выделенных от 3 больных. Штаммы относятся к ST 87. В данном исследовании впервые в России для больных пневмониями из группы риска, находящихся в стационаре, был применен современный алгоритм исследования на легионеллез (бактериологический анализ БАЛ и определение легионеллезного антигена в моче). Ранее столь значительный контингент в России обследовали лишь во время эпидемической вспышки внебольничного легионеллеза в Верхней Пышме.

Важно, что диагноз легионеллеза, установленный с помощью использованных в работе методов, является окончательным, не требует подтверждения другими методами и является основанием для немедленного проведения этиотропной терапии. Легионеллы не относятся к эндогенной микрофлоре, для них не показаны такие важные для современной инфекционной патологии человека феномены, как персистенция или носительство, характерные для многих других возбудителей пневмоний у пациентов групп риска. В отличие от вирусной или пневмоцистной инфекций, при которых выявление возбудителя в жидкости БАЛ не является доказательством соответствующей этиологии, выделение легионелл из разрушенных альвеолярных макрофагов БАЛ, как и выявление антигена легионелл в моче пациента, свидетельствует об активном развитии легионеллезной инфекции. Не должна вызывать сомнения и сама возможность заражения легионеллами в результате аспирации водопроводной воды или распространения мелкодисперсного водного аэрозоля циркулирующими водными системами (градирни, централизованные водные системы охлаждения и увлажнения воздуха, джакузи). Исследования последних лет свидетельствуют о высоком уровне контаминации легионеллами потенциально опасных водных систем, в том числе в ЛПУ Российской Федерации.

Процент выявленных случаев легионеллеза в данном исследовании (10,5%) не противоречит частоте выявления легионеллезных пневмоний (5—30%) в аналогичных зарубежных исследованиях по анализу этиологии пневмоний среди пациентов групп риска [6, 7].

Применение рекомендованного в данной работе алгоритма исследования требует владения техникой сбора БАЛ или биопсии легкого в ЛПУ. Постановка иммунохроматографического теста для определения антигена легионелл в моче, напротив, доступна самому широкому кругу клинических лабораторий. Иммунохроматографический тест важен при обследовании не только контингентов групп риска в условиях ЛПУ, но и для более широкого спектра пневмоний: дифференциальная диагностика тяжелых внебольничных пневмоний, пневмоний путешественников (travel-associated legionellosis). При тяжелых формах пневмококковой и легионеллезной пневмонии (в отличие от средней тяжести микоплазменной и хламидийной инфекции) липополисахаридный антиген возбудителя можно выявить в моче. Поскольку клинически дифференцировать тяжелую пневмококковую и легионеллезную пневмонию практически невозможно, применение данного методического подхода позволяет в течение 30—40 мин установить окончательный диагноз. Простота и доступность иммунохроматографического метода позволяет рекомендовать его для обследования всех больных тяжелыми пневмониями. Методика диагностики легионеллеза с помощью ПЦР и бактериологического исследования БАЛ представляется перспективной для включения в протокол обследования гематологических больных и других пациентов группы риска с легочными осложнениями.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail