Тромбофилия - основная причина акушерских и гинекологических патологий. Под тромбофилией понимают повышенную склонность организма человека к тромбообразованию вследствие генетически обусловленных или приобретенных дефектов системы гемостаза.

На сегодняшний день известен целый ряд наследственных форм тромбофилии. Они могут быть обусловлены либо генетическими дефектами непосредственно в системе гемостаза, включая мутации в генах коагуляционных факторов (гены антикоагулянтной и фибринолитической систем, гены гликопротеинов тромбоцитарных рецепторов), либо вторичными причинами вследствие других генетических поломок [1, 2] (рис. 1).

Наиболее значимой и частой формой генетически обусловленной тромбофилии является мутация Лейден в гене коагуляционного фактора 5 (F5 1691G>A). В гетерозиготном состоянии мутация Лейден встречается у 2-6% европейцев. Вследствие данной мутации, приводящей к замене аминокислоты аргинина на глутамин в положении 506, замедляется деградация фактора 5 активированным протеином С (АПС), стабилизируется протромбиназный комплекс, отмечается увеличение скорости образования тромбина, что приводит к развитию резистентности к АПС и к повышенному тромбообразованию [1-5]. Мутацию фактора 5 выявляют у 20-40% больных с венозными тромбозами и тромбоэмболиями. Будучи в гетерозиготном состоянии, мутация Лейден сопряжена с 3-7-кратным увеличением риска тромбообразования, в гомозиготном состоянии этот риск повышен в 80-100 раз. Мутация отмечена у 60% женщин с тромбозами во время беременности и в послеродовом периоде [2].

Другой причиной генетически обусловленной тромбофилии является мутация в гене коагуляционного фактора 2 или протромбина (F2 20210G>A), локализованная в 3'-концевой нетранслируемой области гена [1, 2, 6]. У носителей данной мутации повышен уровень протромбина, что, вероятно, связано с усилением синтеза белка при наличии аллели 20210A из-за увеличения стабильности мРНК фактора 2 и/или повышения эффективности ее трансляции [6]. Риск развития тромбозов у носителей данной мутации возрастает в 2-5 раз. В общей популяции мутация встречается с частотой 2-3%, а у больных с венозными тромбозами - 6%. При наличии этой мутации у беременных риск венозной тромбоэмболии значительно возрастает [1, 2, 7]. Аллель 20210А обнаружен у 7,8% женщин с потерей плода [8]. Показана ассоциация данной мутации с внутриутробной задержкой развития плода (ВЗРП), преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты (ПОНРП) и с гестозом. У женщин с тяжелым гестозом данная мутация встречается в 4-11% случаев, а у здоровых беременных - в 1-4% [8].

В последние годы в качестве одной из причин тромбофилии рассматривается гипергомоцистеинемия, которая может быть обусловлена изменениями в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) [1, 2, 5]. Наиболее изученным является полиморфизм 677С>Т, приводящий к образованию термолабильной формы фермента со сниженной на 50% активностью [1]. Протромботический эффект гипергомоцистеинемии может быть обусловлен токсическим действием гомоцистеина на эндотелий сосудов, в результате которого повышается прокоагулянтный потенциал эндотелиальных клеток [2]. При гипергомоцистеинемии может возникать резистентность к АПС вследствие ковалентного соединения гомоцистеина с активированным фактором 5 [7]. Частота генотипа 677ТТ в Европе варьирует от 5 до 15%. Аллель 677T в гомозиготной форме выявляется у 10-20% больных с различными видами тромбозов. Установлено, что замена 677С>Т MTHFR может быть фактором риска развития многих осложнений при беременности, включая ПОНРП, ВЗРП, синдром потери плода, дефекты заращения невральной трубки (ДЗНТ) и гестоз [2, 7].

Наряду с нарушениями коагуляционной системы к тромбофилии могут приводить и мутации генов факторов фибринолитической системы [7]. Индел (вставка/делеция) 5G/4G в гене ингибитора активатора плазминогена 1-го типа PAI1 в –675 положении от стартовой точки транскрипции может приводить к ослаблению фибринолиза и гиперкоагуляции вследствие повышения уровня PAI1 в крови при наличии аллеля –675 4G и снижения активации плазмина [7]. Наличие аллеля –675 4G отмечено при многих осложнениях беременности - бесплодии, ранних проэмбриональных и эмбриональных потерях, неудачах ЭКО и гестозах [2, 8].

В последние годы в качестве факторов риска развития гестоза рассматриваются замены –455G>A в 5'-промоторной области гена, кодирующего β-субъединицу фибриногена (FGB) и 1565Т>С в гене гликопротеина ITGβ3 (GP3α), также приводящих к тромбофилии.

Таким образом, к наиболее значимым факторам риска тромбофилии относят мутации в генах системы свертывания крови, фибринолиза и гликопротеиновых рецепторов.

Данный алгоритм включает 7 последовательных этапов: отбор пациентов, взятие крови, выделение ДНК, выявление генетических форм тромбофилии, описание и интерпретацию результатов генетического тестирования, подготовку рекомендаций.

Согласно нашему опыту, генетическое тестирование для выявления тромбофилии желательно для всех беременных женщин. Оно особенно показано в случае тромбозов в анамнезе, наличия таковых у кого-либо из близких родственников, наличия варикозной болезни, при невынашивании и других осложнениях беременности, наличии ревматизма, заболеваний почек, артериальной гипертензии, ожирения и др.

На втором этапе проводится забор венозной крови. Во избежание свертывания, кровь необходимо собирать в пробирки для клинических гематологических исследований с К3ЭДТА.

Известно множество способов выделения ДНК. В последнее время широкое распространение получили методы, позволяющие экстрагировать высокоочищенную ДНК, а также автоматизировать процесс. Существует широкий спектр коммерческих наборов реагентов, производимых отечественными и зарубежными компаниями.

Наиболее простым, относительно дешевым, не требующим дорогого оборудования и безопасным является солевой метод выделения ДНК в соответствии с бесфенольной методикой, которую мы рекомендуем использовать [9].

Для выявления генетических нарушений, ассоциированных с тромбофилией, предлагаются разнообразные молекулярно-генетические методы: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов после полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с аллель-специфичными праймерами (ПЦР-АСП), метод «обратной дот-блот гибридизации» (ПЦР-АСО), ПЦР в реальном времени, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP), масс-спектрометрические методы, метод биочипов и многие другие [1]. Предлагается также метод детекции мутаций без предварительной амплификации непосредственно на геномной ДНК (инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader).

Благодаря простоте и надежности метод ПЦР-ПДРФ получил особенно широкое распространение. Определение полиморфного сайта с помощью этого метода заключается в ПЦР-амплификации интересующего фрагмента и его расщеплении соответствующей рестриктазой. Дальнейшее разделение продуктов рестрикции с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле позволяет на основании различной длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) выявлять искомую мутацию.

Весьма распространенным является и метод ПЦР-АСП, при котором аллельные варианты различаются в результате использования аллель-специ­фичных праймеров (АСП), комплементарных нормальному или мутантному аллелю. ПЦР проводят в двух пробах для каждой ДНК, которые отличаются друг от друга АСП. Реакция проходит только в образце, в котором исследуемый фрагмент ДНК содержит участок, комплементарный одному из двух АСП. Обнаружение ПЦР-продукта в обеих пробах свидетельствует о гетерозиготном носительстве исследуемой аллели. Важным преимуществом данного метода является возможность быстрого получения результата. Оба метода: и ПЦР-ПДРФ, и ПЦР-АСП благодаря своей скорости, простоте и надежности широко применяются для диагностики наследственной тромбофилии. Они позволяют идентифицировать все известные мутации, приводящие к высокому риску тромбозов.

Для выявления мутаций, предрасполагающих к тромбофилии, также применяют метод ПЦР в реальном времени. Преимуществами данного метода являются возможность детекции ПЦР-продуктов в процессе реакции, исследование их кинетики, отсутствие стадии электрофореза, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. За счет высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов данный метод обладает высокой специ­фичностью и позволяет идентифицировать точечные мутации.

Несмотря на несомненные преимущества, все эти методы не применимы в случае необходимости одномоментной детекции мутаций в нескольких генах или в разных локусах одного гена. В случае полигенных заболеваний, к которым относится и тромбофилия, практически важным является разработка методов диагностики, позволяющих в одной пробирке одновременно определять несколько точковых мутаций в одном образце. Наиболее перспективной в этом случае является технология биочипов, которая наряду с мультиплексностью и миниатюрностью имеет такие преимущества, как быстрота, эффективность, высокая специфичность и простота.

В НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН сов­местно с Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгель­гардта РАН разработан Фибр-биочип (Тромбо-биочип), предназначенный для выявления генетически обусловленных форм тромбофилии [1]. Фибр-биочип позволяет одновременно анализировать вариабельные участки 6 (7) генов (F5 1691G>A, F2 20210G>A, PAI1 –675 5G>4G, FGB –455G>A, ITGβ3 1565Т>С и MTHFR 677C>Т (F7) и выявлять для каждого из них по 2 аллеля: «дикого» и «мутантного» типов. На рис. 2 представлена схема Фибр-биочипа.

Олигонуклеотидные пробы, расположенные в ячейках микрочипа, представляют собой фрагменты перечисленных 6 генов. Для исключения ошибок и повышения точности каждая проба на микрочипе продублирована. Олигонуклеотиды в двух верхних строках соответствуют последовательностям «дикого» типа, в двух нижних - «мутантным» последовательностям. Подобное расположение облегчает регистрацию результатов гибридизации. Выявление флюоресцентного сигнала в ячейках двух верхних строк биочипа для каждого из 6 генов означает, что анализируемый образец содержит аллели дикого типа. Сигналы в нижних строках свидетельствуют о наличии «мутантных» аллелей. Наличие сигнала в ячейках одного из столбцов означает гетерозиготное носительство аллелей для каждого из генов. Варианты гибридизационных сигналов приведены на рис. 3.

Для анализа полученных результатов разработано специальное программное обеспечение, позволяющее в полуавтоматическом режиме определять генотипы исследуемых образцов ДНК (рис. 4).

Согласно нашему опыту, для выявления генетически обусловленных форм тромбофилии (F5 1691G>A, F2 20210G>A, FGB –455G>A, ITGβ3 1565Т>С, PAI1 –675 5G>4G, MTHFR 677C>Т) следует использовать Фибр-биочип.

Результаты генетического тестирования можно представить в виде таблицы, содержащей информацию о проанализированных маркерах (гены, мутации/полиморфизмы), генотипах пациента и риске развития заболевания.

Пример «стандартного» варианта ответа по результатам генетического тестирования на наличие наследственно обусловленной тромбофилии у пациентки К. приведен в табл. 1.

В настоящее время нет единой системы оценки результатов генетического анализа. По нашему опыту, наиболее удобным для объективизации полученных данных является балльный метод. Для этого каждому аллелю протестированных генов присваивают определенный балл в зависимости от вклада этого гена в риск заболевания, после чего проводят подсчет баллов по формуле: М=Σm/k, где М - относительная сумма баллов, m - сумма баллов всех индивидуальных генотипов, а k - число изученных генов. Высокому риску развития осложнений соответствует интервал М от 1,1 балла и выше, умеренному - от 0,9 до 1,1, а низкому - от 0 до 0,9.

Согласно нашему опыту и данным литературы, для жительниц Северо-Западного региона России гомозиготам по мутации F5 Лейден и полиморфизму 20210G>A по гену протромбина F2 следует присваивать максимально высокий балл риска - 4. Гетерозиготам по мутации F5 Лейден и полиморфизму 20210G>A по гену протромбина F2, а также гомозиготам по мутации 677С>Т в гене MTHFR давать балл - 3. Гетерозиготность по мутации 677С>Т и гомозиготность по мутациям в гене рецептора тромбоцитов ITGB3 и в гене PAI1 оценивать в 2 балла. Гетерозиготам по «неблагоприятным» аллелям генов ITGB3 и PAI1, а также гомозиготам по полиморфизму в гене фибриногена FGB присваивать 1 балл. Остальные аллели всех протестированных генов учитываются как 0 баллов (табл. 2).

Исходя из предложенной балльной оценки, пациентка К. имеет относительную сумму баллов, равную 1,5, и находится в группе высокого риска развития осложнений беременности (табл. 3).

Полученный результат для пациентки К. указывает на необходимость профилактических мероприятий, чтобы максимально снизить риск осложнений беременности.

Генетическое тестирование наряду с анамнестическими и клинико-лабораторными данными является лишь одним из составляющих при оценке риска акушерских осложнений. Наличие генетической предрасположенности свидетельствует о повышенном риске осложнений беременности и требует применения комплекса профилактических мероприятий.

Последний включает коррекцию экстрагенитальной патологии, прегравидарную оценку показателей свертывающей системы крови, динамический контроль при беременности. Дезагреганты и антикоагулянты назначаются под контролем показателей свертывания крови. Женщинам группы умеренного риска рекомендуется коррекция гемостаза при возникновении нарушений свертывающей системы крови во время беременности. В случае низкого риска и наличия беременности - показаны наблюдение 1 раз в 4 нед и прием поливитаминов [2].