Кожа волосистой части головы при псориазе часто поражается первой, и нередко высыпания сохраняются в течение многих лет, тогда как на других участках кожного покрова они разрешаются [1, 2]. Особенности строения кожи больных псориазом на электронно-микроскопическом уровне изучены недостаточно [3—5 и др.]. В основном исследования посвящены строению кутикулы волос у больных псориазом в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ). Полученная информация фрагментарна и противоречива. Принято считать, что грибы рода Malassezia являются физиологической микробиотой кожи человека и их присутствие может способствовать обострению псориаза [6, 7 и др.].

Цель исследования — выявить наличие структурных различий пораженной и непораженной частей кожи скальпа и ее придатков при псориазе с помощью метода СЭМ, а также апробировать экспресс-метод негативного контрастирования для изучения микроорганизмов непосредственно в эпидермальных чешуйках для их выявления и изучения особенностей строения в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ).

Материал и методы

Пациентка М., 52 года, обратилась с жалобами на зуд и высыпания на коже волосистой части головы. Считает себя больной последние полгода с момента, когда после сильного стресса появились первые высыпания. При осмотре в краевой зоне роста волос (затылочной, лобной, височных областях), а также на темени множественные эритематозные бляшки диаметром до 2 см с умеренной инфильтрацией и выраженным среднепластинчатым шелушением. На коже разгибательной поверхности предплечий единичные псориатические высыпания. Симптомы псориатической триады воспроизводились в полном объеме. PSSI 58, PASI 6,7. Пациентка обследована (РМП, ф50, HBsAg, antiHCV), патологии не выявлено. Со стороны клинических, биохимических показателей без особенностей. При трихометрии псориатических бляшек на затылочной области с помощью программы Trichoscience и камеры Aramo-SG (Корея) выявлено снижение средней плотности волос на 1 см² (235,0) и уменьшение средней толщина волос (0,05 мкм).

Для СЭМ взяты 2 панч-биопсии диаметром 3 мм с кожи волосистой части головы в затылочной области (биоптат с краевой зоны псориатической бляшки и с непораженной кожи между бляшками). Панч-биопсии скальпа с пораженной и непораженной его частей фиксировали в 3% глутаральдегиде (на какодилатном буфере, pH 7,2) 3 ч, затем постфиксировали в течение ночи в 1% OsO₄, обезвоживали в серии спиртов (30→50→70%), а затем высушивали при критической точке (HCP-2) 15 мин, напыляли золотом и изучали в СЭМ JSM 35 (Jeol, Япония).

С целью выявления и детального изучения интактных дрожжевых клеток, локализующихся в чешуйках скальпа, использовали метод ТЭМ — негативного контрастирования с помощью ФВК. Для этого микробиологической петлей часть эпидермальных чешуек, собранных с пораженной и непораженной областей кожи скальпа, перемещали на 10 мин в стерильные пластиковые пробирки Эппендорфа для микропроб (1,5 мл), содержащие физиологический раствор (0,1 мл). Полученные взвеси переносили автоматической пипеткой на электронно-микроскопические медные сетки диаметром 3 мм, покрытые прозрачной формваровой подложкой-пленкой. Далее на сетки с материалом на 10 мин наносили 1,5% раствор ФВК (рН 6,7), который окрашивал объекты негативно в черный цвет и позволял в ТЭМ четко выявить детали их ультраструктурной организации. Сетки после окрашивания ФВК промывали дистиллированной водой, перемещали на сухую фильтровальную бумагу, расположенную в чашке Петри, высушивали 10 мин и исследовали в ТЭМ Jem 100-SX (Jeol, Япония).

Результаты и обсуждение

Пораженная кожа. Сканирующая электронная микроскопия

Изучение структуры поверхности эпидермиса в промежутках между волосяными фолликулами при малом увеличении сканирующего микроскопа (рис. 1, а) выявило наличие плотно прилегающих друг к другу мелкоскладчатых образований неправильной формы, покрытых биопленками специфического строения. Последние дискретные, разной площади и формы, варьирующей толщины, покрывали поверхность эпидермиса мозаично (см. рис. 1, б, стрелки). При большом увеличении СЭМ было видно (см. рис. 1, в), что пленки состояли из скоплений одиночных или собранных в небольшие группы бактерий кокковидной (0,5—0,9 мкм, см. рис. 1, в, стрелки) либо удлиненной (2,0—5,0×5,0—6,0 мкм) формы, соединенных между собой тонкими (0,08 мкм), рыхло и хаотично расположенными тяжами (см. рис. 1, в, головки стрелок). В межфолликулярных зонах кожные чешуйки отсутствовали (см. рис. 1, д).

Рис. 1. Особенности строения кожи и ее придатков пораженного участка кожи скальпа больного псориазом.

а—в — поверхность эпидермиса между волосяными фолликулами; г — общий вид образца; д — волосяные воронки; е — кутикула волоса; ж — строение дрожжевых клеток малассезий в ТЭМ после окрашивания ФВК. Здесь и на рис. 2: В — воротничок; ДК — дрожжевая клетка; Пч — почка.

В биоптате кожи скальпа было 10 волос (см. рис. 1, г), в 4 случаях они располагались попарно. Диаметр волос варьировал от 44,4 до 66,0 мкм (в среднем 55,2 мкм). Наружный край волосяной воронки слабо выражен и несколько отставал от стержня волоса (см. рис. 1, д). Волосяные воронки четко отграничены присутствующими скоплениями невысоких, вертикально ориентированных тонких чешуек небольшого размера (см. рис. 1, д, стрелки). Чешуйки кутикулы волос слабо развиты, шириной 2—3 мкм, плотно расположены относительно друг друга; их неровные края не заходили друг на друга (см. рис. 1, е), а свободные края отслаивались и неплотно прилегали друг к другу. Поверхность большей части чешуек волоса разрушена, ее структура на этих участках мелкозернистая, часто встречаются небольшие щелеобразные полости (см. рис. 1, е, стрелки), присутствие которых оголяет корковое вещество стержня. Общая картина структурной организации таких волос напоминала древесину, изъеденную жуками.

Трансмиссионная электронная микроскопия кожных чешуек

Изучение кожных чешуек в ТЭМ с помощью метода окрашивания ФВК показало, что в них крайне редко наблюдали дрожжевые клетки, которые располагались небольшими группами (см. рис. 1ж). Они эллипсоидной (2,0—2,5×3,0—3,3 мкм) формы, с широким воротничком, редко почковались монополярно. Дочерние клетки округлой формы.

Непораженная кожа. Сканирующая электронная микроскопия

Строение поверхности кожи эпидермиса в промежутках между волосяными фолликулами было иным по сравнению с пораженной кожей. Она повторяла контур клеток эпидермиса (рис. 2, а). Количество кожных чешуек больше (см. рис. 2, а, стрелки), чем в пораженном участке кожи. Они мелкие, с неровными, часто приподнятыми краями, что характерно для физиологического шелушения.

Рис. 2. Строение кожи и ее придатков непораженного участка кожи скальпа больного псориазом.

а — поверхность эпидермиса между волосяными фолликулами; б — общий вид образца; в, г — волосяная воронка; д — кутикула волоса; е — строение дрожжевых клеток малассезий в ТЭМ после окрашивания ФВК.

В коже биоптата 20 волос, они расположены графтами по 2—3 волоса (см. рис. 2, б). Диаметр волос от 32,0 до 64,0 мкм (в среднем 48,0 мкм). Вокруг волосяных воронок анализируемого образца присутствовали многослойные, в основном вертикально расположенные тонкие чешуйки (см. рис. 2, в, 2, г, стрелки). Они более крупные, чем вблизи волосяных воронок пораженной кожи. Чешуйки кутикулы волос хорошо выражены, разной толщины (1—3 мкм), со слегка неровным краем (см. рис. 2, д). В целом структура поверхности волос имела характерный «черепитчатый вид». Каких-либо нарушений в строении кутикулы волос данного варианта не выявлено. На поверхности кожи скальпа биопленки отсутствовали.

Трансмиссионная электронная микроскопия кожных чешуек

Дрожжевые клетки в кожных чешуйках после окрашивания ФВК и изучения в ТЭМ наблюдали крайне редко. Они одиночные или в небольших группах (см. рис. 2е), эллипсоидной (2,4—2,5×3,3—3,5 мкм) формы, редко почкующиеся. Почкование монополярное, дочерние клетки округлой формы.

В целом, по данным СЭМ, при псориазе выявлены изменения как в строении поверхностного слоя кожи, так и ее придатков. Специфическая особенность строения эпидермиса непораженных участков кожи — наличие многочисленных кожных чешуек. Небольшое число кожных чешуек только в области волосяной воронки. Бактерии в чешуйках пораженных и непораженных участках кожи отсутствовали.

На пораженном псориазом участке кожи частота встречаемости волос в 2 раза меньше, чем на непораженном. Снижение плотности роста расположения волос на пораженных участках скальпа отмечено и другими авторами [9, 10]. Достоверных различий в значениях среднего диаметра волос пораженных и непораженных участков кожи скальпа не выявлено. Кутикула волос пораженного участка по сравнению с непораженным выглядела разрушенной, дистрофичной. Наши исследования согласуются с данными литературы о наличии серьезных дистрофических изменений в строении кутикулы волос пораженных псориазом участков кожи скальпа [2—5] — по данным авторов, в кутикуле волос отмечены такие дистрофические изменения, как слабая ее выраженность, «рваный» край, наличие трещин или углублений в виде «трещин» разной глубины. Разнообразие дистрофических изменений в кутикуле волос пораженных псориазом участков можно объяснить разным их возрастом, разной длительностью и тяжестью течения псориаза конкретного случая, а также отягощенностью пациента другими сопутствующими заболеваниями.

Заслуживает внимание тот факт, что на поверхности участка псориатической бляшки выявлены многочисленные бактериальные биопленки. Интересно, что аналогичные бактериальные пленки с тонкими тяжами в их составе ранее обнаружены при изучении венозных катетеров [8]. Часто в биопленках слизь является основным матриксом, в который погружены микроорганизмы. Поскольку в исследованных биопленках слизь отсутствовала, то очевидно, что ее функциональная нагрузка падает на тонкие, хаотично расположенные тяжи органического происхождения, являющиеся, скорее всего, продуктами метаболизма микроорганизмов. Присутствие биопленок на поверхности псориатической бляшки можно рассматривать в качестве индикатора ее неблагополучного состояния, сопряженного с наличием зуда кожи у пациентки.

В настоящем исследовании впервые сделана попытка применения метода негативного контрастирования ФВК для быстрого выявления и изучения микробиоты чешуек кожи в ТЭМ. Применение данного метода позволило выявить в чешуйках скальпа дрожжевые клетки, которые по размерам, а также по наличию широкого рубчика и монополярного почкования можно отнести к роду Malassezia [9, 10 и др.]. В чешуйках пораженного участка кожи по сравнению с непораженным малассезии встречались реже, что можно объяснить неблагоприятными условиями для их жизнедеятельности. Исследование показало, что особенности морфологии дрожжевых клеток в чешуйках пораженных и непораженных участков кожи сходны.

Продемонстрирована перспективность использования метода негативного контрастирования ФВК в диагностических целях, поскольку он позволяет быстро и достоверно выявить в ТЭМ наличие микроорганизмов непосредственно в биоматериале, а также уточнить некоторые чрезвычайно важные детали их строения, которые невозможно выявить классическими культуральными методами исследования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – В.Г. Корнишева, К.И. Разнатовский

Сбор и обработка материала – О.А. Смолина

Проведение электронномикроскопических исследований – А.А. Степанова.

Написание текста – А.А. Степанова, В.Г. Корнишева, О.А. Смолина

Редактирование – К.И. Разнатовский

Authors’ contributions:

The concept and design of the study – V.G. Kornisheva, K.I. Raznatovskiy

Collecting and interpreting the data – O.A. Smolina

Carrying out of the electronmicroscopic investigations – A.A. Stepanova

Drafting of the manuscript – A.A. Stepanova, V.G. Kornisheva, O.A. Smolina

Revision of manuscript – K.I. Raznatovskiy

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.