Список сокращений:

MALDI-TOF-MS — времяпролетная MALDI-TOF масс-спектрометрия

МИК — минимальная ингибирующая концентрация

ОНМТ — очень низкая масса тела

ОРИТН — отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ЭНМТ — экстремально низкая масса тела

Введение

Среди всех инфекционных заболеваний в мире первое место по распространенности занимают микозы. Тяжелыми и хроническими микозами страдают свыше 300 млн людей, умирают от системных грибковых инфекций до 1,5 млн пациентов различных возрастных групп ежегодно. В последние 30 лет в связи с увеличением частоты применения в составе медикаментозной терапии иммуносупрессантов, антибактериальных препаратов, а также с ростом числа иммунокомпрометированных пациентов распространенность грибковых инфекций неуклонно увеличивалась. Особую группу составляют недоношенные новорожденные, среди которых наиболее уязвимой категорией пациентов в плане развития системных грибковых инфекций являются дети с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой (ЭНМТ) массой тела при рождении [1].

Частота встречаемости инфекционных заболеваний и сепсиса у новорожденных тем выше, чем меньше гестационный возраст и масса тела ребенка при рождении: у новорожденных с массой тела менее 1000 г (ЭНМТ) частота развития сепсиса составляет 20,8%, 1000 г и выше — 1%. Это связано с рядом морфологических и функциональных особенностей систем органов у недоношенных детей, которые являются причиной их уязвимости [2].

Среди микозов новорожденных, особенно у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ, наиболее опасными являются системные грибковые инфекции, в этом случае смертность может достигать 40% [3]. Основным возбудителем грибковых инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) являются грибы рода Candida. Однако в последние десятилетия появляется все больше сообщений о вспышках грибковых инфекций, вызванных дрожжеподобными грибами рода Malassezia [4]. Ранее было принято полагать, что грибы рода Malassezia вызывают только такие кожные заболевания, как разноцветный лишай и себорейный дерматит. В настоящее время установлено, что эти грибы могут вызывать разнообразные заболевания с преимущественной локализацией патологического процесса на коже и слизистых оболочках, причем не только у взрослых, но и у детей. Эти инфекции могут демонстрировать различный характер течения — от малосимптомных до диссеминированных поражений и сепсиса.

Выделяют истинно грибковые заболевания кожи, обусловленные грибами рода Malassezia, или малассезиозы, такие как разноцветный лишай и малассезиа-фолликулит, а также заболевания, ассоциированные с Malassezia, — самостоятельные заболевания воспалительного генеза, диагностируемые у пациентов любого возраста. К наиболее часто встречающимся малассезиа-ассоциированным дерматозам относят неонатальные акне (цефалический краниальный пустулез), атопический дерматит, себорейный дерматит, ретикулярный папилломатоз, болезнь Лейнера — Муссу, синдром Иова и др. [5].

У новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ в силу их иммунологической незрелости и склонности к генерализации возникших инфекционных процессов встречаются, как правило, системные малассезиа-ассоциированные заболевания.

Распространенность видов дрожжевых грибов

По данным многочисленных наблюдений, 97% клинически здоровых людей являются носителями дрожжевых грибов на коже головы, 92% — на коже туловища. В связи с этим в последние годы исследования грибов, входящих в состав нормального микробиома кожи, вызывают значительный интерес. При использовании некультуральных методов исследования установлено, что наиболее многочисленными эукариотами, представляющими 50–80% общего кожного микробиома, являются дрожжевые грибы Malassezia spp., которые присутствуют на всех участках тела, кроме стоп [6].

Исследования процесса колонизации грибами здоровой кожи человека показали, что она варьирует от 5% на первой неделе жизни до 30% на 2–4-й неделе жизни. У новорожденных детей колонизация кожи грибами рода Malassezia spp. начинается сразу при рождении и увеличивается до возраста 6–12 мес. Используя молекулярно-биологические методы, японские ученые выявили Malassezia spp. в 89% образцов, полученных с поверхности кожи новорожденных сразу после родов, и в 100% образцов у новорожденных в первый день жизни. В исследовании участвовали доношенные новорожденные, приложенные к груди матери в первые сутки жизни [7]. Наиболее вероятным механизмом обсеменения кожи, продемонстрированным японскими исследователями, является прямой контакт новорожденного с кожей матери. В дальнейшем колонизация кожи человека остается относительно низкой вплоть до периода полового созревания, когда происходит активация сальных желез, обеспечивающая лучшую среду обитания, и популяция дрожжей вновь возрастает до стабильно высокого уровня [6].

В педиатрическом отделении детского госпиталя (штат Канзас Сити, США) A.A. Paul и соавт. провели исследование с целью охарактеризовать кожный микробиом доношенных и недоношенных детей, определить детерминанты, влияющие на состав кожного микробиома, а также взаимосвязь с полиморфизмом генов TLR4, NLRP3, CARD8 и NOD2 [8]. В исследовании приняли участие 15 доношенных детей (масса при рождении 3188±538 г, гестационный возраст 38,6±1,3 нед) и 15 недоношенных детей (масса при рождении 1015±269 г, гестационный возраст 27±2,6 нед). У всех детей взяты образцы соскобов с поверхности кожи лба, локтевой ямки, ягодичной области в первые 48 ч после рождения и между 2-й и 4-й неделей жизни, а также образцы крови при рождении. Наиболее распространенными представителями кожного микробиома явились Malassezia (преобладающий род), Candida, Cladosporium, Fusarium и Cryptococcus. Достоверных различий между группами новорожденных авторы не выявили. Применение антибиотикотерапии увеличивало колонизацию кожи новорожденных грибами, преимущественно C. albicans. В то же время было показано, что окружающая среда может влиять на состав микробиома кожи: дети, находившиеся в ОРИТН, имели более разнообразный микробиом кожи по сравнению с детьми, находившимися в домашних условиях. Исследование генов врожденного иммунитета показало, что полиморфизм гена TLR4 (rs4986791) ассоциировался с более низким грибковым разнообразием, но определение его клинической значимости требует проведения дополнительных исследований. Два полиморфных локуса (rs6672995 и rs4353135, по данным ряда авторов, связанных с геном NLRP3) ассоциировались с измененным количеством дрожжей Malassezia spp. и Candida spp., а также грибов рода Fusarium. Ген NOD1 (rs6958571) был связан со сниженным количеством Malassezia spp. Кроме того, выявлена тенденция к увеличению количества Malassezia spp. при ассоциации с полиморфизмом гена CARD8 (rs2043211). Примечательно, что изученные полиморфизмы в гораздо меньшей степени ассоциировались с изменениями количества бактерий. Только полиморфизм гена NOD2 (rs2066844) продемонстрировал взаимосвязь с изменениями в бактериальном составе микробиома кожи [8].

Многочисленные исследования распределения видов Malassezia spp. на коже человека показали широкую вариабельность результатов, зависящую от географического региона. Группа ученых (G. Gaitanisa и соавт.) в 2012 г. провела анализ литературы, включавший более 20 исследований из разных стран, посвященных распространенности видов грибов рода Malassezia spp. на коже здоровых людей и при различных дерматологических заболеваниях [4]. Вне зависимости от используемых методов диагностики (культуральных или молекулярно-биологических) наиболее распространенными видами грибов рода Malassezia spp. оказались M. globosa и M. restricta, затем M. sympodialis, M. furfur и M. slooffiae. В то же время авторы отметили географические различия в распространенности некоторых видов грибов: M. dermatis был выделен в Восточной Азии (Япония и Южная Корея), M. obtusa — в основном в Швеции, Канаде, Боснии и Герцеговине.

Эпидемиология и патогенез заболеваний, вызванных грибами рода Malassezia

Первые представители грибов рода Malassezia были выделены и описаны в 1846 г. Эйштейдом (Eichstedt) как возбудители разноцветного лишая, однако свое название они получили лишь в 1889 г. благодаря Байлону (Baillon), который и поставил их во главе нового рода. Долгое время считалось, что грибы этого рода существуют в двух формах: мицелиальной и дрожжепободной. Объединение двух форм произошло в 1977 г., когда практически одновременно 2 группы исследователей (Dorn, Roehnert и Nazzaro-Porro и соавт.) доказали возможность прямого перехода возбудителя от одной формы к другой in vitro. Со временем таксономия грибов рода Malassezia претерпела множество изменений, в настоящее время их относят к зооантропофильным диморфным дрожжеподобным базидомикотам (класс Малассезиомицеты) и насчитывают 17 видов [9]. В дрожжевой форме грибы представляют собой нормальный микробиом кожи, после перехода в мицелиальную форму они могут проникать в роговой слой, тем самым индуцируя кожные заболевания. По этой причине в последние годы грибы рода Malassezia рассматриваются не только как комменсал, но и как патоген.

Патофизиология кожных заболеваний, вызванных или усугубляемых Malassezia spp., окончательно не выяснена из-за сложных взаимодействий этих грибов с кожей. Грибы рода Malassezia (за исключением M. pachydermatis) не способны синтезировать de novo жирные кислоты, что обусловлено отсутствием у них генов, кодирующих синтазу жирных кислот в клетках. Это обстоятельство определяет необходимость использования грибковыми клетками для поддержания процессов жизнедеятельности источников липидов, содержащихся в секрете сальных желез (триглицериды, жирные кислоты, восковые эфиры, сложные эфиры стерола, холестерин, сложные эфиры холестерина и сквален). Чтобы обеспечить свои потребности в липидах грибы рода Malassezia выделяют такие ферменты, как эстеразы, липазы, липоксигеназы и протеазы. В здоровой коже грибы Malassezia spp. используют необходимые питательные вещества для роста, не вызывая заболевания. Когда этот процесс нарушается, дрожжи адаптируются, модифицируя экспрессию ферментов, участвующих в получении энергии, и в роговом слое происходит гидролиз триглицеридов. Конечным продуктом этой реакции служат арахидоновая и олеиновая кислоты, которые, в свою очередь, разобщают связи между кератиноцитами, приводя к спонгиозу. Нарушенный эпидермальный барьер позволяет проникнуть клеткам гриба глубже в эпидермис. Кератиноциты, взаимодействуя с ферментами оболочки гриба, вырабатывают хемокины, цитокины и антимикробные пептиды, вызывая воспаление и зуд. В то же время дрожжи синтезируют ряд биоактивных индолов, таких как индирубин и индол (3,2-b) карбазол (ICZ), которые взаимодействуют с клетками кожи через арилуглеводородный рецептор (AhR). В результате этого взаимодействия снижаются иммунный ответ клеток Лангерганса, продукция ими воспалительных медиаторов, индуцируется апоптоз клеток и изменение ультрафиолет-индуцированного меланогенеза [10].

Между тем опубликованы результаты исследований, свидетельствующие о том, что, несмотря на наличие липофильных свойств у грибов, отдельные их виды обнаруживают в урогенитальном и гастроинтестинальном трактах человека. Исследователи из департамента пищевых наук и технологий (Университет Небраски, США) показали, что грибковая флора кишечника менее стабильна по сравнению с бактериальной флорой и зависит от типа питания и условий окружающей среды. Так, грибы рода Malassezia присутствовали в 50% образцов, полученных у пациентов, придерживавшихся вегетарианской диеты [9]. В исследовании M. Alsterholm и соавт. в отделении дерматовенерологии Университетской больницы Сальгренска (Гетеборг, Швеция) при обследовании 102 пациентов с баланопоститом и 26 клинически здоровых мужчин грибы рода Malassezia выявили у каждого пятого пациента с баланопоститом и примерно с такой же частотой в группе контроля. Наиболее часто встречаемыми видами являлись M. globosa, M. obtusa, M. sympodialis, M. restricta и M. slooffiae. Авторы предположили, что клинические проявления баланопостита, возможно, являются генитальной манифестацией себорейного дерматита [12]. Однако объем проведенных исследований нельзя признать удовлетворительным.

Пути передачи возбудителя

Долгое время единственным возбудителем системных микозов, вызванных грибами рода Malassezia, считали M. furfur. В настоящее время установлены уже 3 вида грибов, способных вызвать гематогенную диссеминацию инфекции: M. furfur, M. sympodialis и M. pachydermatis [6, 11–14]. Первые 2 вида являются представителями нормального микробиома кожи человека, тогда как M. pachydermatis колонизирует преимущественно кожу животных и является одной из причин отитов у собак. Исследования процесса инфицирования пациентов в ОРИТН свидетельствуют о возможности передачи возбудителя от медперсонала к пациентам. Кроме того, описаны случаи вспышек в ОРИТН малассезиа-ассоциированных инфекций, обусловленных M. pachydermatis [15].

В исследовании C.-Y. Huang и соавт. обследованы 77 сотрудников ОРИТН, в котором произошла вспышка инвазивного микоза, вызванная грибами M. pachydermatis. Среди сотрудников 2 страдали псориазом, 3 — экземой, еще у 2 были зарегистрированы эпизоды себореи, у 26 выявлены другие кожные заболевания. Были также обследованы 39 домашних животных сотрудников, у 12 из них была выделена культура M. pachydermatis. На основании полученных результаов авторы выдвинули гипотезу о возможности передачи возбудителя от домашних животных через медицинский персонал к пациентам отделения. Более того, были описаны механизм формирования биопленок грибов и возможность их длительного сохранения на поверхности медицинских приборов [16].

K. Zomorodian и соавт., используя культуральные и молекулярно-генетические методы, исследовали частоту выявления Malassezia spp. на коже новорожденных, госпитализированных в отделения интенсивной терапии новорожденных в госпитале г. Шираз, а также на коже их матерей. Всего исследовано 205 образцов от 130 новорожденных старше 4-дневного возраста и 75 матерей. Выделение Malassezia spp. с поверхности кожи осуществляли с использованием среды Лиминга—Нотмана и модифицированной среды Диксона. Рост культур Malassezia spp. обнаружен у 62,3% новорожденных и 77,3% матерей. Malassezia globosa оказался наиболее распространенным видом, обнаруженным на коже участников исследования. Примечательно, что с поверхности кожи одного новорожденного был выделен редкий вид рода грибов Malassezia — Malassezia arunalokei. Дополнительно проведено секвенирование 92 образцов грибов Malassezia, полученных от новорожденных и их матерей. Сходство между последовательностями грибов Malassezia spp., полученных от матерей и их новорожденных, составило 76%. Авторы сделали вывод, что грудное вскармливание в значительной степени обусловливает колонизацию новорожденных грибами [22].

В последние годы в связи с повышением количества выхаживаемых глубоко недоношенных детей и усовершенствованием методов лабораторной диагностики возник новый виток интереса к грибам Malassezia. Широкое распространение грибов рода Malassezia на коже человека, способность ряда видов этих грибов при определенных условиях реализовывать свой патогенный потенциал и приводить к развитию тяжелых системных грибковых инфекций с летальным исходом обусловливают необходимость дальнейшего изучения этой проблемы.

Лабораторная диагностика грибковых инфекций

Современная диагностика системных грибковых инфекций основывается на использовании классических микробиологических методов (культуральное исследование крови, ликвора, глубокого трахеобронхиального аспирата и биологического материала из других локусов) с последующей идентификацией грибов до вида при использовании времяпролетной MALDI-TOF-масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS), что позволяет врачам-клиницистам принимать правильные решения при выборе антимикотического препарата. Согласно рекомендациям ESCMID 2012, для диагностики грибковых инфекций у новорожденных необходимо осуществлять исследование гемокультуры в количестве не менее 2 мл не менее 2 раз в сутки в течение 3 дней подряд. Важно отметить, что объем циркулирующей крови у глубоко недоношенных новорожденных варьирует от 90 до 100 мл на 1 кг массы тела, что в совокупности со значительными трудностями выполнения пункций интактных вен становится существенным ограничением в применении культуральных методов [23].

Более того, грибы Malassezia spp. практически не культивируются на селективных для дрожжевых грибов плотных питательных средах, не размножаются в стандартных питательных средах для гемокультивирования и соответственно не могут быть выделены и идентифицированы традиционными культуральными методами, что создает определенные сложности при проведении диагностического поиска.

В связи с этим, очевидно, существует необходимость в усовершенствовании методов лабораторной диагностики малассезиа-ассоциированных заболеваний. Широкое использование в диагностической практике в последнее десятилетие получили молекулярно-генетические методы, позволяющие проводить не только качественную, но и количественную оценку исследуемых мишеней. Возможности таких методов продемонстрированы, они активно применяются для выявления возбудителей различной природы, однако недостаточно задействованы при исследовании микозов.

В диагностике возбудителей малассезиа-ассоциированных заболеваний все большую популярность приобретают такие молекулярно-генетические методы, как ПЦР в режиме реального времени и секвенирование 18(26)S pРНК, позволяющие провести точную и быструю идентификацию грибов до вида при использовании минимального количества биологического материала в кратчайшие сроки [17].

N.K. Abd El-Aziz и соавт. проведено исследование для оценки эффективности применения в клинической практике методов идентификации возбудителей бактериального сепсиса: MALDI-TOF-MS и ПЦР в режиме реального времени. В исследовании использованы образцы крови (n=20) и гноя (n=50) животных с подозрением на септицемию, а также образцы цельной крови новорожденных (n=30) с подозрением на системную бактериальную инфекцию [18].

Результаты исследования показали высокую чувствительность обоих методов. По сравнению с микробиологическими методами, обладающими такими ограничениями, как необходимость временных затрат для получения чистых культур из полимикробных образцов (например, образцов гноя) и трудоемкость этапа пробоподготовки, идентификация возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени оказалась эффективнее, обладала высокой чувствительностью и требовала значительно меньше времени для получения результата. Эти преимущества имеют существенное значение для своевременного назначения адекватной терапии.

В то же время видовая идентификация рода Malassezia с помощью MALDI-TOF-MS несколько затруднена, поскольку существующие базы данных содержат ограниченное количество видов.

ПЦР в режиме реального времени хорошо адаптирована для нужд клинической практики. На российском рынке представлен набор реагентов для выявления и типирования возбудителей грибковых инфекций рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaromyces методом ПЦР в режиме реального времени (МикозоСкрин), позволяющий быстро и точно выявлять дрожжевые грибы в различных биологических образцах и уже зарекомендовавший себя как один из важных инструментов в диагностике инвазивных микозов у новорожденных, а также некоторых дерматологических заболеваний. К основным достоинствам метода относится в первую очередь возможность выполнения анализа любых биологических материалов, при котором для исследования достаточно 0,1–0,5 мл образца, что позволяет также следить за динамикой состояния пациента на фоне проводимой терапии и оценивать количество ДНК грибов в различных биологических материалах пациентов на различных этапах наблюдения. Для выполнения исследования методом ПЦР в режиме реального времени требуется в среднем около 4 ч. Сокращение времени на исследование дает врачу возможность своевременного назначения таргетной антимикотической терапии и, как следствие, ведет к снижению числа летальных исходов и возникновения инвалидизирующих расстройств у новорожденных различного гестационного возраста.

Особенности терапии системных грибковых инфекций у новорожденных

Для лечения инфекций, вызванных грибами рода Malassezia, у новорожденных детей в настоящее время применяют 3 класса препаратов: азолы, эхинокандины и полиены. Следует отметить, что первые две группы препаратов имеют сравнительно невысокую эффективность при лечении системных инфекций, вызванных грибами рода Malassezia, в отличие от полиенов, в то время как последние обладают выраженной нефротоксичностью.

Результаты исследований резистентности in vitro показали широкую вариабельную чувствительность Malassezia spp. к различным противогрибковым средствам. В исследовании F.D. Rojas и соавт. вид M. sympodialis был наиболее восприимчивым, а M. furfur — наименее восприимчивым к противогрибковой терапии [21]. Кетоконазол, итроконазол и вориконазол оказались наиболее активными препаратами и имели низкую вариабельность чувствительности среди различных видов дрожжей. Флуконазол, миконазол и амфотерицин B обладали широким диапазоном минимальных ингибирующих концентраций. K.A. Hammer и соавт. обнаружили, что кетоконазол более эффективен против штаммов M. furfur, выделенных от пациентов с системной инфекцией, чем эконазол и миконазол, однако при лечении инфекций, вызванных другими видами грибов, эффективность этих препаратов была одинаковой [19]. Амфотерицин B оказался достаточно активным в отношении M. pachydermatis и в меньшей степени активным в отношении штаммов M. furfur, вызывающих фунгемию. Вариабельность результатов, полученных в разных лабораториях, связана с отсутствием стандартизованного протокола для определения чувствительности маласезиомицетов к антимикотическим препаратам [19–21].

Заключение

Малассезиа-ассоциированные заболевания являются гетерогенной группой заболеваний, включающей в себя как местные, так и системные инфекции, вызываемые дрожжевыми грибами рода Malassezia у пациентов различных возрастных групп. Эпидемиология грибковых инфекций, связанных с грибами рода Malassezia, остается в значительной степени недооцененной во многом из-за ограничений методов лабораторной диагностики. Тем не менее системные грибковые инфекции требуют быстрой и точной идентификации возбудителя, а также своевременного назначения таргетной лекарственной терапии для предупреждения летальных исходов и инвалидизации пациентов. Результаты исследований чувствительности возбудителей к антимикотическим препаратам свидетельствуют о том, что видовая идентификация Malassezia spp. может иметь решающее значение для выбора адекватной терапии. Ряд ограничений существующих методов лабораторной диагностики открывает возможности для широкого применения и дальнейшего совершенствования молекулярно-генетических методов в диагностике малассезиа-ассоциированных заболеваний у пациентов различных возрастных групп, в том числе у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.

Не менее актуальной является задача оптимизации алгоритма обследования и лечения пациентов различного гестационного возраста с локальными и системными формами малассезиа-ассоциированных инфекций.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Строкова С.О., Никитина И.В., Донников А.Е.

Сбор и обработка материала — Строкова С.О.

Написание текста — Строкова С.О.

Редактирование — Никитина И.В., Донников А.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России №121032500123-2.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — Strokova S.O., Nikitina I.V., Donnikov A.E.

Collecting and interpreting the data — Strokova S.O.

Drafting the manuscript — Strokova S.O.

Revising the manuscript — Nikitina I.V., Donnikov A.E.

Financing. The work was carried out within the framework of the state task of the SIC AGIP named after V.I. Kulakov of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 121032500123-2.