Введение

В настоящее время наблюдается тенденция роста удельного веса инфекций в общих показателях заболеваемости человечества. Значительная их часть приходится на долю хронических инфекций, более половины — у людей с ослабленной иммунной системой, когда заболевания вызваны инфекционными агентами, вполне обычными для окружающей среды человека, например, бактериями P. aeruginosa, обитающими повсеместно. Один из механизмов хронического инфекционного процесса связан с образованием бактериями биопленок, характеризующихся повышенной резистентностью бактерий в биопленках к антимикробным препаратам. Термин «биопленка» (biofilm) был введен известным американским исследователем J. Costerton, положившим начало интенсивным исследованиям этого феномена [1]. Механизмы устойчивости бактерий в составе биопленок к лекарственным препаратам и антибиотикам во многом известны, в их основе — структурные особенности организации биопленок [2—4]. На поиск средств борьбы с биопленочными инфекциями в мире направляются большие научные и материальные ресурсы, однако результаты свидетельствуют о том, что проблема борьбы с биопленками остается одной из наиболее актуальных общемировых медицинских проблем [5—7]. Биопленочные сообщества способны к дисперсии — выделению и распространению отдельных клеток для последующей колонизации новых поверхностей и образованию новых биопленочных сообществ. Обнадеживающим результатом изучения процессов образования и дисперсии биопленок является разработка новых терапевтических и профилактических подходов, включая использование NO-содержащих соединений.

В одной из работ была показана эффективность химически нестабильных диазениумдиолатов осуществлять локальное генерирование NO в местах скопления микробных биопленок. Их образование связали со способностью NO индуцировать дисперсию в очень низких, не токсичных концентрациях (микро- или пикомолярных). По-видимому, так NO участвует в коммуникации бактерий, живущих в межвидовых биопленках, и появляется возможность использования NO-ингибиторов для избирательной дисперсии биопленок именно патогенных бактерий [6]. Оксид азота синтезируется в бактериальных клетках. Бактериальные NO-синтазы функционируют в большинстве грамотрицательных бактерий. Они синтезируют NO in vitro и in vivo, однако их физиологическая роль мало изучена.

В бактериальной клетке важнейшая функция NO — зашита от окислительного стресса, вызванного активными радикалами кислорода ROS и азота NOS. В E. coli это комплекс систем репарации ДНК, контролируемых Oxy R, SoxRS, SOS и FNR — регулонами. Самый надежный путь усиления резистентности бактерий к оксидантам, включая антибиотики, — это уменьшение ROS, NOS и пероксинитрита ONOO — супероксиддисмутазой SOD. В E.coli NO активирует необходимую систему SoxRS, ее активность в Pseudomonas spp. не изучалась [8].

Ранее мы получили сравнительные данные о негативной регуляции и снижении уровней формирования биопленок Pseudomonas sp. донором NO S-нитрозоглутатионом GSNO и его восстановленной формой GSH-свободным и в составе БАД глутатион- комплекса и сформулировали рекомендации по их практическому использованию [9].

Часто монооксид азота NO осушествляет функции формирования и дисперсии биопленок более активно во взамодействии с другим газотрансмиттером H2S. Так, комплексная обработка клеток P. aeruginosa PA 103 0,5 mM донором NO — тетранитрозильным комплексом железа с тиосульфатом (ТНКЖтио) и альтернативным газотрансмиттером H2S рост биопленок подавлялся в 3—6 раз в сравнении с монообработкой NO при соотношении компонентов обработки (1:10) [10].

Поскольку время жизни молекулы NO крайне ограничено, в фундаментальных и прикладных исследованиях стали использовать его значительно более стабильные доноры с разнообразными лигандами, природными и синтетическими [11]. В клетках всех биосистем это формирующиеся из NO, клеточного железа и природных тиолов — цистеин, глутатион и другие динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) — «рабочая форма оксида азота в живых организмах» [12], которые обладают всеми свойствами NO-миметиков. Окислительно-восстановительные взаимодействия форм оксида азота (NO⁺/NO^•/NO^–) играют важнейшую роль мессенджеров в физиологических и терапевтических процессах, в том числе в противоопухолевой активности и взаимодействии между хозяином и патогеном [10, 11]. В новейшей литературе все более пристальное внимание уделяется изучению и анализу функций катиона нитрозония NO⁺ — одной из структур в составе биядерных ДНКЖглу с тиолами [12].

Механизмы бактерицидного действия доноров оксида азота, содержащих катион NO⁺, был установлен после 70 лет широкого использования нитритов для подавления роста гнилостных бактерий, включая Clostridium botulinum и Clostridium sporogenes [13]. Многочисленные наблюдения подтвердили, что нитрит сам по себе плохой ингибитор роста клостридий: при pH 7.0 он неэффективный нитрозирующий агент, содержащий очень низкую фракцию азотистой кислоты — 0,022%. Азотистая кислота, оксид азота и железо-сера-нитрозильные комплексы обладали ингибирующей активностью, поскольку все они продуцировали катион NO⁺. Впоследствии было окончательно установлено, что бактерицидные эффекты соединений с такой структурой обязаны способности аккумулировать NO⁺ [13, 14].

На основе результатов исследований с использованием методов физико-химии и электронного парамагнитного резонанса были сформулированы идеи возможного появления высокоактивного катиона нитрозония NO⁺ в биологических системах. Среди них — использование способности производных дитиокарбомата селективно связывать молекулы сигнального оксида азота NO из структур моно- и биядерных динитрозильных комплексов железа и продуцировать NO⁺ и мононитрозильные комплексы железа (MNIC), которые не обладают сигнальными функциями (рис. 1).

Рис. 1. Схема взаимодействия моно- и биядерных динитрозильных комплексов железа (М и Б-ДНКЖ) с диэтилдитиокарбоматом (ДЭТК).

В связи с этим целью нашей работы было экспериментальное изучение функций катиона нитрозония NO⁺ как своеобразного блокатора для сигнальной молекулы NO в регуляции роста биопленок P. aeruginosa.

Материал и методы

Все исходные соединения для синтеза донора оксида азота В — DNIC-GSH, а также NaNO₂ диэтилдитиокарбомат — ДЭТК и буфер HEPES получены от фирмы Sigma (St. Louis, США). Синтез NO доноров, проведение ЭПР-исследований и снятие их оптических характеристик контролировались методами амперометрии, масс- и ЭПР-спектроскопии. Как правило, для приготовления растворов тест-соединений использован буфер HEPES, pH 7.4. NaNO₂ растворяли в дистиллированной* воде со слабокислым pH.

Изучение активности доноров оксида азота и ДЭТК в формировании биопленок проводили на клетках штамма P. aeruginosa 32 (клинический изолят от больного мочекаменной болезнью). Клетки этого штамма характеризуются множественной антибиотикорезистентностью, в том числе и к ципрофлоксацину. Для позитивного контроля был использован антибиотик ципрофлоксацин (2 мкг/мл).

Для тестирования способности и уровня образования биопленок использована общепринятая методика формирования биопленок в 96-луночных микротитровальных планшетах. Эксперименты проводили в 4 повторностях. Оптическую плотность планктонных клеток и интенсивность окраски растворов изучали на спектрофотометре при длине волны 596 нм. Для окраски биопленок использовали 0,1% спиртового раствора красителя кристаллического фиолетового (45 мин). Не связавшийся краситель и планктонные клетки удаляли и прикрепившиеся клетки трижды промывали физраствором. Экстракцию связанного красителя из бактериальных клеток проводили 96% этанолом. Статистическая обработка данных и построение гистограмм проводились с использованием программы Graph Pad Prism 9.

Результаты и обсуждение

Для изучения взаимодействия катиона нитрозония NO⁺ с сигнальной молекулой NO и их влияния на рост биопленок P. aeruginosa 32 впервые использовали комплекс индукторов — доноров оксида азота с ДЭТК. Предварительно был изучен эффект разных концентраций каждого из препаратов доноров NO — Б-ДНКЖглу (G) и NaNO₂ (N), а также ДЭТК (D) на рост P. aeruginosa. Установлено, что 0,25 мМ—2,5 мМ дозы этих соединений существенно не влияли на рост планктонных клеток P. aeruginosa (данные не приводятся).

Однако на рост биопленок эти препараты по-разному влияли (рис. 2). Так, Б-ДНКЖглу (G) в концентрации 0,25 мМ—1,25 мМ приводил к резкому росту биопленок по сравнению с K+, а другой донор NO (NaNO₂) в концентрациях от 0,5 до 1,25 мМ почти не оказывал влияния на рост биопленок. Однако ДЭТК (D) в концентрациях 1,25—2,5 мМ незначительно ингибировал рост биопленок.

Рис. 2. Дозовая зависимость роста биопленок P. aeruginosa 32 при монообработке клеток Б-ДНКЖ_глу(G) и ДЭТК (D), в сравнении с необработанным контролем (К+ ) и 2 мкг/мл ципрофлоксацина (К-Ц).

Здесь и на рис. 3, 4: по оси ординат — оптическая плотность (OD 596 нм) окрашенных красителем кристаллическим фиолетовым спиртовых экстрактов бактериальных биопленок. По оси абсцисс — концентрации растворов препаратов G, N и D (мМ/мл). К+ — рост биопленок контрольного штамма P. aeruginosa; К+ Ц — то же, но при внесении ципрофлоксацина; К — интенсивность окраски лунок с LB.

Суммарная обработка клеток препаратами G и D [G1.25+D2.5] в 3 раза снижала рост биопленок относительно монообработки G (рис. 3), а наибольший эффект ингибирования наблюдался в варианте с 10-кратным превышением концентрации D над G (2,5 мМ D против 0,25 мМ G) (см. рис. 3). Таким образом, при всех сочетаниях доз этих двух препаратов достоверный результат ингибирования роста биопленок достигался при превышении концентрации ДЭТК относительно донора G.

Рис. 3. Зависимость роста биопленок P. aeruginosa 32 от концентрации Б-ДНКЖ_глу(G) и ДЭТК (D) при моно- и суммарной обработке клеток и 40-минутном интервале перед внесением ДЭТК (D) после Б-ДНКЖ_глу(G), в сравнении с необработанным контролем (K+).

В модифицированном варианте суммарной обработки клеток донором оксида азота и ДЭТК было предусмотрено введение 40-минутного интервала между инкубацией клеточной компонента — ДЭТК. Целью этой модификации было создание селективных условий для контакта ДЭТК с пулом накопленных в течение 40 мин молекул донируемого NO. Результаты этого исследования представлены на рис. 3 и 4: различия в росте биопленок — в сравнении с вариантом постоянного присутствия в бактериальной суспензии обоих соединений — были неоднозначны. Наиболее значительные результаты в варианте с 40-минутным интервалом были зарегистрированы в варианте с нитритом натрия (см. рис. 4) при эквимолярных соотношениях компонентов обработки 1.25 N:0,5 D. Эффект влияния таких доз B-DNIC-GSH и NaNO₂ на образование биопленок свидетельствует о том, что нитрит натрия был менее эффективным и, соответственно, показатели OD 596 в этом случае были выше. Важно, что изученные сочетания концентраций препаратов N и D не оказывали существенного влияния на процесс роста планктонных клеток (светлые столбики на рис. 4).

Рис. 4. Зависимость роста биопленок (темные столбцы) и плотности суспензии (светлые столбцы) P. aeruginosa 32 от концентрации NaNO₂(N) и ДЭТК (D) при моно- и суммарной обработке клеток и 40-минутном интервале перед внесением ДЭТК после NaNO₂(N), в сравнении с необработанным контролем (K), и внесением ципрофлоксацина (К+Ц, 2 мкг/мл).

Итак, в работе установлено 2,5—3-кратное ингибирование роста биопленок P. aeruginosa при комплексной обработке донорами оксида азота с ДЭТК. Выявлены оптимальные количественные соотношения активных компонентов при обработке. Для максимального ингибирования роста биопленок целесообразно использование NaNO₂ с ДЭТК в соотношении N 1,25 + D 1,25 (1:1) (см. рис. 3), а для варианта с G это G 0,5+D 2,5 (1:5).

В регуляции роста биопленок применяли комплексную обработку клеток не одним, а двумя газотрансмиттерами, либо их сочетанием с антибиотиками [10]. При этом различия в результатах снижения роста биопленок могут объясняться не только использованием различных штаммов и активных соединений, но и главным образом мишенями их активности в клетках. Мишени активности NO уникальны и хорошо изучены. Это SH- и Fe-S-группы белков, а его сигнальные функции связаны с тиольной модификацией и формированием соответствующих оксидативных повреждений. Так, установлено, что белок IscR[2Fe-2S], необходимый для активации рекомбиназы E в фимбриях E. coli для связи биопленок с субстратом, относится к семейству AraC (MarA/Rob/SoxS/FuR) и, по-видимому, функционирует как активатор устойчивости бактерий к антибиотикам (в том числе к хинолонам) путем образования биопленок. Это свидетельство взаимосвязи в клетке фундаментальных биологических процессов реконструкции Fe-S-кластеров в железо-серных белках с формированием биопленок [10].

Итак, в проведенной работе впервые установлена новая фундаментальная функция производного ДЭТК как эффектора процесса формирования биопленок псевдомонадами в ответ на нитрозативный стресс. При этом ДЭТК действует опосредованно, через избирательное накопление катионов нитрозония NO⁺. Этот катион — реактивный интермедиат многочисленных химических и биохимических реакций. Полученные нами косвенные доказательства избирательной ингибирующей активности NO+ в бактериальных клетках коррелируют с аналогичными результатами на других биообъектах. В клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae катион нитрозония NO⁺, но не оксид азота NO, ингибировал респираторную осцилляцию в продуценте этанола в хемостате, объем которой коррелировал с потенциалом реакций NO⁺-нитрозирования элементов редокс-системы клеток [14].

Химия NO⁺ важна для понимания биологической роли оксида азота, а знание механизмов, вызванных им повреждений ДНК, необходимо для анализа природы модификаций генетического материала и эволюции биосистем. В живых организмах содержится масса молекул с нуклеофильными центрами, которые, очевидно, могут формировать комплексы с NO⁺. Но пока спектроскопические методы прямого изучения NO⁺ и его комплексов отсутствуют, эти исследования ограничиваются и затрудняются. Тем не менее, имеющиеся результаты пилотных исследований свидетельствуют в пользу необходимости развития этого направления в науке об оксиде азота.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.