Использование многомерного дискриминантного анализа в диагностике нейросифилиса

Нейросифилис (НС) — тяжелое заболевание, вызванное Treponemapallidum, приводящее к поражению центральной и вегетативной нервной системы, результатом чего служит значительное снижение качества жизни, инвалидизация пациентов, а иногда и летальный исход, особенно в случаях несвоевременного выявления болезни.

В последние десятилетия проблема НС приобрела значительную актуальность в связи с ростом заболеваемости как в Российской Федерации, так и в Москве. В России c 2013 по 2015 г. отмечен рост заболеваемости поздними формами сифилиса на 52,1%, в том числе НС [1].

Число случаев НС в Москве с 2009 по 2014 г. возросло почти в 10 раз, что может быть связано как с истинным ростом заболеваемости, так и с улучшением выявления. В 2015—2017 гг., в том числе по статистическим данным Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии за 2010—2017 гг. (не опубликованы), число зарегистрированных случаев НС в Москве несколько снизилось, но тем не менее продолжает оставаться достаточно высоким [2].

В статье О.В. Колоколова и соавт. «Нейросифилис вернулся» отмечено, что в 1997 г. О.К. Лосева и соавт. в журнале «Врач» опубликовали статью под названием «Нейросифилис возвращается…», однако сегодня приходится признать, что НС «вернулся» [3, 4]. По прогнозам авторов статьи, при наблюдаемом в последние годы росте заболеваемости НС общая заболеваемость им к 2020 г. может превысить 25 на 100 тыс. населения, а заболеваемость манифестным НС к 2020 г. — преодолеть планку 2,5 на 100 тыс. населения.

Частота возникновения НС, по данным литературы [5, 6], составляет при первичном сифилисе 10—20%, при вторичном — 30—70%, при скрытом — 10—30%.

Согласно данным современной литературы, НС часто развивается у лиц со скрытыми, поздними формами сифилиса, а также у лиц с серорезистентностью — пациентов, в прошлом перенесших одну из ранних форм сифилиса, у которых в течение 1 года и более после завершения специфической терапии нетрепонемные серологические реакции крови на сифилис сохраняют свою позитивность [7].

Распознавание НС по клиническим признакам в настоящее время достаточно проблематично в связи с тем, что заболевание часто протекает бессимптомно, имеет неспецифичную клиническую симптоматику, при этом отсутствуют или слабо выражены патогномоничные для НС неврологические симптомы, что затрудняет диагностику и многими авторами объясняется, прежде всего, лекарственным патоморфозом. Из субъективных симптомов на первый план сейчас выступают не стреляющие и рвущие боли, парестезии, а жалобы на вялость, слабость, подавленность, бессонницу, пониженную работоспособность, составляющие астеноневротический синдром. Больные Н.С. могут жаловаться на головную боль, у них могут наблюдаться эпилептические припадки, признаки инсульта, нарушение чувствительности, проблемы со зрением [8—11].

Субъективные и объективные клинические симптомы поражения нервной системы у больных сифилисом могут рассматриваться как НС, но окончательное подтверждение диагноза возможно только после исследования цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) [12, 13]. Однако применяемые при этом регламентированные методологии определения содержания белка и клеточного состава ЦСЖ с подсчетом количества клеток (цитоз) не являются специфичными для сифилиса и нередко дают отрицательный результат при наличии НС [14].

К настоящему времени известен ряд методов диагностики НС, применяемых для уточнения диагноза при сифилитическом поражении нервной системы путем исследования ЦСЖ, в которых выявляются антитела к бледной трепонеме. Это нетрепонемные (НТТ) и трепонемные (ТТ) тесты.

К НТТ относятся реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрых плазменных реагинов (RPR), реакция VDRL (Venereal Disease Research Laboratory test) [15—18]. Данные реакции выявляют реагины — антитела к кардиолипиновому антигену бледной трепонемы. Однако такие антитела могут формироваться в организме и при множестве других заболеваний и состояний. В связи с этим данные реакции недостаточно специфичны [19]. Они могут быть положительными у больных с соматическими заболеваниями (злокачественные новообразования, лейкозы, инфаркт миокарда, ревматоидный артрит и др.), инфекциями (ВИЧ-инфекция, боррелиоз, сыпной тиф и т. д.), а также при некоторых состояниях человека (беременность, многократное донорство, вакцинация и т. д.), у пожилых людей [20].

Существует также ряд ТТ, выявляющих трепонемоспецифические антитела к бледной трепонеме. К ним относятся реакция иммунофлуоресценции с цельным ликвором (РИФц), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), метод иммуноблоттинга (ИБ) [15, 21].

В последнее время появился новый класс наборов реагентов для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — иммуночипы, принцип работы которых основан на непрямом методе выявления антител к спектру антигенов с помощью флуоресцентной детекции [22, 23]. Относительно недавно [24, 25] была разработана экспериментальная тест-система для ликвородиагностики НС с использованием иммуночипа. Иммуночип представляет собой альдегид-активированный стеклянный слайд, на поверхности которого имеется группа микрозон с «напечатанным» в них набором диагностически значимых иммунодоминантных антигенов T. pallidum с молекулярной массой 47, 17, 15 и 42—44 килодальтон (TmpA). Для выявления образовавшихся иммунных комплексов антиген-антитело проводят их инкубацию с конъюгатом, представляющим собой смесь антител к IgG и IgM человека, меченных флуорофорами Cy5 и Cy3. Оценка результатов тестирования проводится с помощью флуоресцентного сканера. Обработка флуоресцентных профилей иммуночипов проводится с использованием программного обеспечения SpotScout («Ditabis», Германия). Образец считают положительным, если в нем выявлены антитела к одному антигену T. pallidum и более, и отрицательным, если значения флуоресценции для всех иммобилизованных антигенов меньше порогового значения. Результаты исследования выражают в условных единицах.

Таким образом, все перечисленные реакции как нетрепонемные, так и трепонемные, предполагают иммунологическое исследование ЦСЖ путем определения антител, образующихся при Н.С. Однако НТТ, применяемые для диагностики НС, не являются абсолютно специфичными. ТТ высокочувствительны и специфичны при постановке с сывороткой крови больных сифилисом. Однако при исследовании ЦСЖ ТТ в ряде случаев могут дать ложноотрицательный результат, что затрудняет интерпретацию результатов и установление диагноза НС [14].

Одним из возможных подходов к диагностике НС и дифференциальной диагностике различных форм НС может стать математический подход, осуществляемый, в частности, с использованием многофакторного (множественного, или многомерного) дискриминантного анализа (МДА). Сущность МДА заключается в поиске новых признаков, называемых дискриминантными функциями (ДФ), на основе использования совокупности исходных показателей. При этом каждой группе пациентов соответствует своя Д.Ф. Получаемое значение ДФ позволяет отнести пациента к той или иной группе с соответствующей ей нозологией.

В сифилидологии ряд авторов при проведении научных исследований использовали методологию дискриминантного анализа. Так, Е.В. Соколовский для уточнения длительности заболевания сифилисом у пациентов с серорезистентностью (до 6 мес и более) применил принцип дискриминантного анализа с использованием ряда лабораторных показателей сыворотки крови (содержание гемоглобина, относительное количество моноцитов, цветной показатель; значение реакции связывания комплемента с кардиолипиновым и трепонемным ультраозвученным антигеном, микрореакции преципитации; величина натурального логарифма титра специфического IgG; СОЭ, относительное количество палочкоядерных лейкоцитов) и анамнестических данных (указание на применение антибиотиков в анамнезе) [26]. Математической обработке было подвергнуто три группы показателей, величина каждого из которых в отдельности более или менее менялась в зависимости от стадии сифилиса и длительности развития инфекции. Все показатели использовались в исходных (до начала специфической терапии) значениях. Для каждой из комбинаций была вычислена дискриминантная формула (D), определены значения дискриминантной разграничительной функции (DF) и вычислена достоверность определения длительности болезни при использовании этой формулы (р), что позволяло отнести пациента к той или иной группе (длительность заболевания до 6 мес или более). Распределение пациентов по длительности заболевания позволило автору разработать аргументированный подход к ведению пациентов с серорезистентностью.

Н.В. Фриго [20] для дифференциации двух нозологий/состояний — раннего скрытого сифилиса (РСС) и ложноположительных результатов серологических реакций на сифилис (ЛПР) — применила метод линейных ДФ в вариантах последовательной диагностической процедуры (ПДП) и дискриминантной диагностической процедуры (ДДП). ПДП предполагала суммирование заранее рассчитанных диагностических коэффициентов до момента достижения соответствующего диагностического порога, при котором принималось три возможных варианта решения: заболевание А1 (ранний скрытый сифилис), заболевание (состояние) А2 (ЛПР) или «неопределенный ответ» (между порогами). ДДП заключалась в определении суммы диагностических индексов до достижения значения дискриминатора, величина которого сравнивалась с постоянным порогом сравнения. Полученное число при этом принимало два варианта решения: заболевание А1 или заболевание А2. Для проведения дискриминантного анализа использовались результаты серологических реакций (комплекс КСР, РИБТ, РИФ, РМП, ИФА, РПГА). Применение ПДП и ДДП позволило автору разработать эффективный диагностический алгоритм для дифференциальной диагностики между ранним скрытым сифилисом и состояниями пациентов, сопровождавшимися возникновением ложноположительных реакций на сифилис.

В дерматологии методологию дискриминантного анализа применяют для дифференциации клинико-иммунологических особенностей аллергических заболеваний кожи [27]. Автор на основе математического моделирования с помощью дискриминантного анализа и использования ряда клинико-лабораторных показателей (аппликационный накожный тест и исследование иммунологических показателей) создал дискриминантную модель клинико-иммунологических типов аллергических кожных болезней (аллергический контактный дерматит, атопический дерматит и экзема), а также предложил методику расчета, которая позволила с вероятностью более 98% выявлять типы иммунного реагирования при разных аллергических заболеваниях кожи.

При анализе патентной и специальной литературы установлено, что методология дискриминантного анализа применялась также и в других областях медицины. Так, этот метод был использован для решения задачи предоперационной диагностики глиальной опухоли головного мозга, так как существующие клинические, нейровизуализационные и другие методы предоперационной диагностики не обеспечивали требуемой достоверности диагноза [28]. Также дискриминантный анализ применяли при прогнозировании риска развития ретинопатии недоношенных, дифференциальной диагностике бронхиальной астмы, прогнозировании индекса моторики у больных детским церебральным параличом, дифференциальной диагностике преэклампсии и хронической артериальной гипертензии у беременных, изучении чувствительности человека к магнитному полю и определении факторов, влияющих на формирование магнитобиологических эффектов [29—34].

Для диагностики НС методология дискриминантного анализа до настоящего времени не использовалась.

Таким образом, как следует из приведенных данных, диагностику НС в настоящее время трудно признать совершенной. Существующие клинические, иммунохимические и другие методы диагностики не обеспечивают требуемой достоверности диагноза. Вместе с тем, поскольку отмечают рост заболеваемости НС как в РФ, так и в Москве, диагностика НС должна быть точной, быстрой и доказательной, что позволит усовершенствовать подходы к выявлению, ведению и снятию с учета больных НС.

Исследование проведено в ходе выполнения НИР «Современные методы профилактики, диагностики, лечения инфекций, передаваемых половым путем», номер государственной регистрации АААА-А17−117122290024−5, фрагмент «Разработка и внедрение в практику московского здравоохранения новых подходов и алгоритмов лабораторной диагностики нейросифилиса».

Цель настоящего исследования — изучение возможности использования МДА для диагностики и дифференциальной диагностики НС.

Объектом исследования стали образцы сыворотки крови и ЦСЖ, полученные от 91 пациента (62 мужчины и 29 женщин в возрасте от 21 до 71 года) с сифилисом (вторичный, ранний скрытый, поздний скрытый и сифилис неуточненный) и НС.

Для исследований методом МДА пациенты были распределены в две группы:

а) больные НС (67 человек, или 74%) — 1-я группа;

б) больные сифилисом (вторичный, ранний скрытый, поздний скрытый и сифилис неуточненный) без НС (24 человека, или 26%) — 2-я группа.

При выполнении НИР применяли:

— клиническое обследование пациентов;

— лабораторную диагностику — исследование сыворотки крови и ЦСЖ с определением содержания белка (протеинархия), качественного и количественного состава клеток (цитоз в ЦСЖ), постановки НТТ (РМП, VDRL) и специфических ТТ (ИФА, РПГА, РИБТ, РИФ, технология иммуночипов с определением антител к рекомбинантным белкам T. pallidum Tp17, Tp47, Tp15, TmpA — в сыворотке крови, ЦСЖ); всего 12 лабораторных показателей.

Для уточнения диагноза НС по результатам лабораторных анализов биопроб сыворотки крови и ЦСЖ пациентов с НС и сифилисом без НС был проведен МДА [35, 36]. Суть метода заключалась в нахождении для набора m исходных признаков лабораторных анализов X (1), X (2), …, X (m) небольшого количества новых переменных (ДФ), по которым выборки пациентов будут разделяться так хорошо, как только это возможно. Число Д.Ф. равно числу выборок, и каждой группе пациентов соответствует своя ДФ, имеющая следующий общий вид:

Y (1) = a₁₁X₁ + a₁₂X₂ + … + a_1mX_m + C₁;

Y (2) = a₂₁X₁ + a₂₂X₂ + … + a_2mX_m + C₂ ,

где Y (1) и Y (2) — новые переменные, называемые ДФ;

a₁₁ , a₁₂ , …, a_1m — это коэффициенты 1-й ДФ на каждый из признаков (1, 2, ., m);

a₂₁ , a₂₂ , …, a_2m — это коэффициенты 2-й ДФ на каждый из признаков (1, 2, ., m);

X₁, X₂, …, X_m — это признаки (1, 2, …, m), например X₁ — это значение РМП, X₂ – это значение VDRL, …, X_m — это значение TmpA; С₁ и С₂ — это константы для 1-й и 2-й ДФ.

При этом отнесение пациента к той или иной группе (НС или сифилис без НС) выполняется по максимальному значению ДФ после расчета значений ДФ для каждой группы по набору переменных (Х₁, Х₂, …, Х₁₂).

Расчет показателей МДА проводился с использованием пакета программ Statistica 9.0. Проверку точности отнесения пациентов к той или иной группе или установление диагноза с помощью МДА (чувствительность решающих правил) проводили с помощью линейных классификационных функций; проверку различимости групп — путем подсчета D²-квадрата расстояния Махалонобиса. Достоверность распределения пациентов в две группы и информативность признаков оценивали по F-критерию Фишера (критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05).

Результаты применения МДА с сывороткой крови. В ходе выполнения МДА для двух групп пациентов (1-я — НС, 2-я — сифилис без НС) были определены коэффициенты линейных классификационных функций для каждого из 12 использованных лабораторных показателей сыворотки крови (табл. 1).

При этом были получены следующие значения ДФ:

ДФ₁ = –0,721 · РМП + 1,603 · VDRL + 89,232 · РПГА + 0,237 · РИБТ – 1,855 · ИФА + 7,640 · РИФ200 – 0,030 · Тр15 + 0,050 · Тр17 + 0,004 · Тр47 – 0,011 · TmpA – 184,160;

ДФ₂= –1,153 · РМП + 1,75 · VDRL + 90,807 · РПГА + 0,206 · РИБТ – 1,438 · ИФА + 9,748 · РИФ200 – 0,023 · Тр15 + 0,036 · Тр17 + 0,002 · Тр47 – 0,011 · TmpA – 195,421.

Оценка чувствительности решающих правил в двух группах пациентов показала, что при проверке линейными классифицирующими функциями к 1-й группе были неверно отнесены 2 объекта/пациента, ко 2-й группе — 5 объектов/пациентов. При этом НС правильно классифицировался в 96,3% случаев, сифилис без НС — в 66,7% случаев, т. е. каждый 3-й пациент с сифилисом без НС был диагностирован с помощью ДФ (по показателям крови) неверно. Точность дифференциации пациентов на предмет наличия/отсутствия НС составила в целом 89,85%.

Таким образом, при использовании лабораторных показателей сыворотки крови точность диагностики НС в целом оказалась недостаточной. Поэтому в дальнейших исследованиях в качестве объекта исследования использовалась ЦСЖ, и МДА был применен только для показателей ЦСЖ.

Результаты применения МДА с ЦСЖ. В ходе выполнения МДА для двух групп пациентов (1-я — НС, 2-я — сифилис без НС) были определены коэффициенты линейных классификационных функций для каждого из 12 использованных лабораторных показателей ЦСЖ (табл. 2).

При этом были получены следующие значения ДФ:

ДФ₁ = –13,682 – 0,735 · РМП + 0,035 · VDRL + 0,941 · РПГА – 0,011 · РИБТ + 0,445 · ИФА + 3,304 · РИФц – 0,201 · цитоз + 20,022 · белок + 0,003 · Тр15 + 0,000 · Тр17 + 0,001 · Тр47–0,008 · TmpA;

ДФ₂ = –5,741+0,114 · РМП–0,348 · VDRL + 0,653 · РПГА + 0,013 · РИБТ – 1,185 · ИФА + 0,124 · РИФц – 0,186 · цитоз + 22,242 · белок + 0,002 · Тр15 + 0,001 · Тр17+ 0,000· Тр47–0,005 · TmpA.

При оценке чувствительности решающих правил в соответствии со значениями линейных классифицирующих функций к 1-й группе были неверно отнесены 4 объекта/пациента, ко 2-й — 0 объектов/пациентов, т. е. НС правильно классифицировался в 93,2% случаев, сифилис без НС — в 100% случаев. Таким образом, в целом точность дифференциации пациентов на предмет наличия/отсутствия НС составила 95% (табл. 3).

Расчет квадрата расстояний Махаланобиса показал наличие существенных различий между группами (расстояние Махалонобиса равно 19,598) (табл. 4).

Оценка по F-критерию показала высокую достоверность различий между группами (F-критерий между 1-й и 2-й группами составил 17,437; р<0,0000…). Оценка информативности каждого из признаков в двух группах показала, что наиболее информативными признаками для осуществления диагностики НС и его дифференциации от сифилиса без НС являются РИФц (F=14,482; р=0,000323) и ИФА (F=5,963; p=0,017428) (табл. 5).

Таким образом, для определения принадлежности пациента к одной из групп заболевания (НС или сифилис без НС) на основании МДА рассчитываются значения двух ДФ по индивидуальным данным результатов лабораторных исследований ЦСЖ. При этом пациент относится к той группе, для которой получена наибольшая величина Д.Ф. При значении ДФ₁>ДФ₂ диагностируют поражение нервной системы (НС), а при значении ДФ₂>ДФ₁ диагноз НС не устанавливают.

Значения ДФ и дискриминантных коэффициентов, полученные на основании обработки результатов исследования ЦСЖ больных НС методом МДА, могут рассматриваться в качестве математической модели диагностики НС.

Применение технологии обработки результатов лабораторных исследований ЦСЖ методом МДА с расчетом линейных ДФ, применением ряда нерегламентированных в РФ методов исследования (VDRL, определение антител к антигенам T. pallidum с молекулярной массой 15, 17, 41 и 47 кДа в формате иммуночипа) существенно (до 95%) повышает точность диагностики НС, в особенности при получении дискордантных/противоречивых результатов различных методов исследования ЦСЖ; дает возможность выбора тактики ведения пациентов, в том числе определения объема проводимой терапии и прогноза для жизни. На основании полученных результатов исследований разработан «Способ диагностики нейросифилиса» (заявка на патент на изобретение; регистрационный № 2018131297 от 30.08.18).

Значения ДФ и дискриминантных коэффициентов, полученные на основании обработки результатов исследования ЦСЖ больных НС методом МДА, можно рассматривать в качестве математической модели диагностики НС.

Сведения об авторах

Н.Н. Потекаев — д.м.н., проф., директор ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-9578-5490

Е.С. Негашева — младший научный сотрудник отдела фундаментально-прикладных методов исследования МНПЦДК ДЗМ, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0001-5613-6482

О.В. Жукова — д.м.н., проф., главный врач МНПЦДК ДЗМ, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0001-5723-6573

Н.В. Фриго — д.м.н., заместитель директора по научной работе ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0001-6231-971X

М.А. Негашева — д.б.н., проф. кафедры антропологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-7572-4316

Г.А. Дмитриев — д.б.н., проф., главный научный сотрудник отдела фундаментально-прикладных методов исследования МНПЦДК ДЗМ, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-4440-9516

Н.В. Китаева — к.м.н., ведущий научный сотрудник ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-3620-2494

Автор, ответственный за переписку: Фриго Наталия Владиславовна — ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия.
e-mail: frigo2013@yandex.ru