Изучение распространенности возбудителей ИППП (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, T. vaginalis) с помощью ПЦР в реальном времени в формате "МУЛЬТИПРАЙМ"

Инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального тракта — одна из основных причин нарушения репродуктивной функции человека. Из многообразия микроорганизмов, способных вызывать такие заболевания, в первую очередь следует выделить те, этиологическая роль которых считается доказанной. Речь идет о таких возбудителях, как Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, относящихся к группе инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). В последние годы накопилось большое количество данных, свидетельствующих о самостоятельной этиологической роли Mycoplasma genitalium. В частности, в последних работах C. Gaydos [1, 2] показано, что M. genitalium — вторая по частоте после C. trachomatis причина уретритов у мужчин, а при цервицитах в обследованной группе женщин M. genitalium находилась на первом месте. Долгое время основной причиной воспалительных заболеваний органов малого таза, трубного бесплодия, эпидидимита и орхита считали хламидии и гонококки. В работах последних лет показано, что значительную роль при этих осложнениях играет M. genitalium [3]. В настоящее время этот микроорганизм подавляющее большинство зарубежных специалистов рассматривают как безусловно-патогенный, что обусловливает необходимость включить его в перечень потенциальных этиологических агентов при дифференциальной диагностике ИППП.

В последние годы основу лабораторной диагностики многих стран мира составляют методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), из которых в нашей стране наиболее известным является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принятые недавно Европейские протоколы [4—7] ведения больных с ИППП для обнаружения C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium и T. vaginalis рекомендуют использовать в лабораторной диагностике современные МАНК.

В ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора разработаны тесты на основе ПЦР для отдельных возбудителей ИППП. Проведен ряд исследований [8—11], результаты которых свидетельствуют о преимуществе аналитических характеристик разработанных ПЦР-тестов над классическими рутинными тестами. Появление современных вариантов МАНК, в частности ПЦР в реальном времени, в сочетании с возможностью использовать современное оборудование позволило одновременно проводить амплификацию и детекцию ДНК нескольких микроорганизмов. Нами разработан тест на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени — «АмплиСенс-N. gonorrhoeae/C. trachomatis/M. genitalium/T. vaginalis — МУЛЬТИПРАЙМ-FL» для одновременного выявления четырех наиболее значимых патогенных возбудителей ИППП.

Цель нашего исследования — изучение с помощью разработанного теста распространенности возбудителей ИППП — C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium, T. vaginalis — среди пациентов медицинских центров Москвы.

Материал и методы

В период с 2010 по 2011 г. в Центр молекулярной диагностики ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦМД ЦНИИЭ) был направлен клинический материал из разных лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) Москвы для исследования одновременно на четыре возбудителя ИППП — C.trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium и T. vaginalis методом ПЦР в реальном времени. Вели прием пациентов и получали клинический материал врачи разных специальностей: дерматовенерологи, гинекологи, урологи, а также врачи смежных специальностей, ведущие пациентов с патологией органов репродукции. Клиническим материалом являлись мазок из влагалища, соскоб из цервикального канала.

Молекулярно-биологическое исследование

Из полученных клинических образцов выделяли ДНК с помощью набора ДНК-сорб-АМ. Дальнейшее исследование выделенных препаратов ДНК проводили с использованием набора реагентов для ПЦР в реальном времени «АмплиСенс-N. gonorrhoeae/C. trachomatis/M. genitalium/T. vaginalis — МУЛЬТИПРАЙМ-FL» согласно инструкции. Данный набор реагентов включает пары праймеров и флюоресцентно-меченые гибридизационные зонды, специфичные к ДНК четырех указанных микроорганизмов, а также к ДНК внутреннего контрольного образца. При наличии в пробе ДНК одного или нескольких исследуемых возбудителей происходят амплификация и детекция их специфических фрагментов. ПЦР в реальном времени проводили с помощью приборов RotorGen-6000 и RotorGen-Q («Quiagen», Германия).

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных показал, что в общей сложности за указанный период с использованием теста «АмплиСенс-N. gonorrhoeae/C. trachomatis/M. genitalium/T. vaginalis — МУЛЬТИПРАЙМ-FL» были обследованы 8115 пациентов (83,9% женщин, 16,1% мужчин) в возрасте 18—45 лет. Материал был получен в 35 клиниках Москвы. Частота выявления возбудителей значительно варьировала между разными клиниками и находилась в пределах 2,8—24%. Следует отметить, что данные ЛПУ не входят в состав кожно-венерологической службы и являются многопрофильными медицинскими центрами. Результаты анализа распространенности ИППП среди обследованных мужчин и женщин свидетельствуют о том, что доля инфицированных мужчин (11,6%) была выше, чем женщин (6,8%), хотя мужчины составили всего ¹/₆ всех обследованных. Дальнейший анализ позволил определить соотношение тех или иных возбудителей ИППП среди инфицированных пациентов. Наиболее распространенной среди мужчин и женщин является хламидийная инфекция, доля которой у мужчин по сравнению с другими ИППП в 1,2 раза выше (рис. 1, 2).

Рисунок 1. Соотношение выявленных возбудителей среди женщин (n=464).

Рисунок 2. Соотношение выявленных возбудителей среди мужчин (n=152).

Второй по частоте встречаемости у лиц обоих полов является инфекция, вызванная M. genitalium, которая у обследованных женщин обнаруживалась 1,5 раза чаще, чем у мужчин. Наибольшими различия между мужчинами и женщинами были по частоте выявления N. gonorrhoeae и T. vaginalis. У женщин T. vaginalis была третьим по частоте возбудителем ИППП, в то время как на третьем месте у мужчин выявлялся возбудитель N. gonorrhoeae.

Примерно в одинаковом долевом соотношении, как у мужчин, так и у женщин, встречались микстинфекции, вызванные данными возбудителями (рис. 3, 4).

Рисунок 3. Соотношение комбинаций возбудителей при микстинфекциях у женщин (n=51). NG — Neisseria gonorrhoeae, CT — Chlamydia trachomatis, TV — Trichomonas vaginalis, MG — Mycoplasma genitalium.

Рисунок 4. Соотношение комбинаций возбудителей при микст инфекциях у мужчин (n=13). CT — Chlamydia trachomatis, MG — Mycoplasma genitalium, NG — Neisseria gonorrhoeae.

Однако у женщин зарегистрировано 9 разных комбинаций, включая случаи инфицирования одновременно тремя патогенными возбудителями, тогда как у мужчин зафиксированы 3 варианта сочетания возбудителей. Второй по встречаемости комбинацией возбудителей у женщин была C. trachomatis + T. vaginalis, у мужчин — C. trachomatis + N. gonorrhoeae.

В задачи данного исследования не входил анализ клинического статуса пациентов. На данном этапе исследования нас интересовала феноменология распространенности основных патогенных возбудителей урогенитальных инфекций. Это имеет важное значение, учитывая сложившуюся в нашей стране практику назначения лабораторных исследований. Мы провели анализ назначений на ПЦР-исследования в разных медицинских центрах Москвы, включая те, которые уже упоминались. За 2010 г. в ЦМД ЦНИИЭ были исследованы клинические образцы, полученные от 154 272 пациентов (78,4% женщин, 21,6% мужчин), в которых одним из тестируемых возбудителей была C. trachomatis. Установлено, что в исследованиях на урогенитальные инфекции методом ПЦР основную долю (более 95%) составляют те, в которых, помимо C. trachomatis, тестируются условно-патогенные микроорганизмы, прежде всего M. hominis, Ureaplasma, G. vaginalis, Candida и др. (рис. 5).

Рисунок 5. Комбинации проведенных ПЦР-исследований на урогенитальные инфекции (n=154 272). NG — Neisseria gonorrhoeae, CT — Chlamydia trachomatis, TV — Trichomonas vaginalis, MG — Mycoplasma genitalium

Мы подчеркиваем, что речь идет о методе ПЦР в качественном формате, основное преимущество которого —высокая чувствительность — является спорным достоинством для диагностики условно-патогенной флоры. И наоборот, доля назначений на исследования, в которых, помимо хламидий, фигурировали бы другие клинически значимые патогенные возбудители, была менее 5%. Такая диспропорция не может не отразиться не только на учете и регистрации случаев заболевания, но и на выборе адекватной тактики лечения. Причины этого имеют как объективный, так и субъективный характер.

Объективными причинами последнего тезиса являются устаревшая и противоречивая нормативно-правовая база, отсутствие современных стандартов, регламентирующих применение в лабораторной практике молекулярных методов, в частности ПЦР, в то время как в большинстве развитых стран мира основными методами диагностики ИППП являются молекулярно-биологические.

В то же время в нашей стране достаточно давно выпускаются коммерческие тест-системы на базе методов ПЦР и НАСБА, которые прошли процедуру государственной регистрации и разрешены к использованию в лабораторной практике. К субъективным причинам следует отнести часто необоснованное предубеждение клиницистов в отношении молекулярных методов, низкую информированность об их преимуществах.

Заключение

Исторически диагностикой и лечением ИППП в Российской Федерации занимается кожно-венерологическая служба, организационно представленная системой кожно-венерологических диспансеров. Однако в результате изменения законодательства в последние годы стало создаваться большое количество многопрофильных медицинских центров, занимающихся в том числе и вопросами репродуктивного здоровья и имеющих в штате специалистов дерматовенерологического, гинекологического и урологического профиля. В связи с этим необходим единый стандартизированный подход к ведению пациентов с инфекционной патологией органов репродукции. За последние 5 лет разработаны тесты нового поколения, основанные на ПЦР в реальном времени, обладающие по сравнению с классическими тестами более высокой чувствительностью, специфичностью и объективностью полученных результатов. В сочетании с современным оборудованием эти тесты позволяют обнаруживать ДНК нескольких микроорганизмов в одной реакции. Впервые в нашей стране был разработан тест на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени —«АмплиСенс-N.gonorrhoeae/C. trachomatis/M.genitalium/T. vaginalis — МУЛЬТИПРАЙМ-FL», позволяющий с высокой эффективностью выявлять ДНК одновременно четырех ключевых возбудителей ИППП в процессе одной реакции. Выявление данных микроорганизмов должно являться базовой диагностической процедурой при обследовании пациентов с инфекционно-воспалительной патологией репродуктивных органов, а также при проведении профилактических обследований.