В условиях стремительно развивающихся медицинских технологий и фармацевтической промышленности, появления новых эффективных методов лечения сложнейших заболеваний вопрос образования рубцовой ткани остается нерешенным и крайне актуальным во всех хирургических и восстановительных сферах медицины [1, 2]. В любых возрастных категориях восстановительному этапу лечения больных отводится должное внимание [3]. Проблематичо не только подобрать реабилитационное лечение для минимизации рубца, развивающегося в месте операции или травмы, но и своевременно диагностировать тип растущей соединительной ткани, отчего напрямую зависит дальнейшая лечебная тактика. Многие занимаются изучением клинико-морфологических особенностей различных видов рубцов [4]. Важность прогнозирования образования рубцовой ткани в детской практике важна не только для врачей комбустиологов, травматологов, но и хирургов. Развитие патологически избыточных рубцов даже после небольших повреждений и операций с закрытием ран косметическими швами связано с проблемами качества дальнейшей жизни маленьких пациентов [5, 6]. Сформированные патологические рубцы приносят дискомфорт, так как сопряжены с функциональными, косметическими нарушениями, а также нарушают социальную адаптацию человека [7].
Рубец — это соединительная структура, образовавшаяся при репаративных процессах на месте раневого дефекта. При этом результатом физиологического фибриногенеза является образование нормотрофического рубца, на месте которого в дальнейшем формируются слои кожи, не выступающие за ее пределы и не деформирующие окружающие ткани. При этом остается открытой проблема реабилитационных мероприятий для детей с патологическими формами рубцовой ткани.
К таким рубцам относят:
— гипертрофические рубцы. Это рубцовая ткань, которая остается в пределах зоны первичного повреждения и отграничена нормальной кожей;
— келоиды, ложные и истинные фибромы, которые значительно превышают размер травмы и могут разрастаться в окружающую кожу на расстояние от нескольких миллиметров до 2—3 см. Размер рубца не зависит от размеров первоначального повреждения.
Результаты разных исследований в течение последних 20 лет расширяют понимание патогенетических механизмов рубцевания. Однако по-прежнему нет структурированных работ по алгоритму профилактики и лечению патологических рубцов. Особенно значимой эта проблема является у детей с недифференцированной дисплазией соединительной ткани (НДСТ).
Цель исследования — изучить иммуногистохимические особенности различной рубцовой ткани у детей без патологических изменений соединительной ткани и с синдромом НДСТ.
Материал и методы
Под нашим наблюдением находились 217 детей, проходивших лечение на базе детского хирургического отделения ГБУЗ Магаданской областной больницы и отделений ДХО №1 и гнойной хирургии ГБУЗ СК КДКБ г. Ставрополя в период с 2010 по 2020 г. Среди больных было 90 (41,5%) девочек и 127 (58,5%) мальчиков. Возрастное распределение: 3—7 лет — 32 (14,7%) ребенка, 8—12 лет — 64 (29,5%), 13—15 лет — 52 (24,0%), старше 15 лет — 69 (31,8%) (табл. 1). Пациенты разделены на следующие группы: основная — 98 (48,2%) детей с рубцовыми образованиями; группа детей с синдромом НДСТ — 65 (30,0%); контрольная — 43 (24,8%) больных без патологического рубцевания. Для выявления НДСТ использовали критерии Э.В. Земцовского [8], учитывающие наличие 6 внешних фенотипических факторов и более в сочетании с одним признаком дисплазии внутренних органов и более [9, 10].
Таблица 1. Распределение по возрасту пациентов в группах исследований
| Возраст, годы | Основная группа | Группа с синдромом НДСТ | Контрольная группа | Всего |
| 3—7 | 15 | 8 | 9 | 32 |
| 8—12 | 29 | 18 | 17 | 64 |
| 13—15 | 21 | 15 | 16 | 52 |
| >15 | 33 | 24 | 12 | 69 |
| Итого | 98 (48,2%) | 65 (30,0%) | 54 (24,9%) | 217 (100%) |
Примечание. Здесь и в табл. 2—4: НДСТ — недифференцированная дисплазия соединительной ткани.
Все пациенты проходили лечение по поводу травм, ожогов и последствий различных видов хирургических вмешательств, в результате которых сформировались патологические формы рубцовой ткани — гипертрофическая и келоидная (табл. 2). Нормотрофический рубец расценивали как норму, которую рассматривали в контрольной группе. Больных наблюдали в разные периоды: до 6 мес — 96 (44,2%) больных, 1 год — 63 (29,0%), 2,5—3 года — 39 (18,0%), 5 лет — 19 (8,8%).
Таблица 2. Распределение по видам рубцов в основной группе и группе с синдромом НДСТ
| Группа | Гипертрофический вид рубца | Келоидный вид рубца | Всего |
| Основная | 81 | 17 | 98 |
| С синдромом НДСТ | 44 | 21 | 65 |
| Итого | 125 (76,6%) | 38 (23,4%) | 163 |
Гистологическому исследованию послужил операционный материал рубцовой и интактной кожи, полученный при первичных или повторных реконструктивных оперативных вмешательствах. Другой метод взятия участка — при помощи одноразового устройства для биопсии кожи Dermo Panch («Sterylab», Италия). Данное исследование утверждено этическим комитетом СтГМУ, от 12.12.09, протокол №7. Получено информационное согласие на исследование у пациентов или их родителей. После иссечения или точечной биопсии фрагмент кожи помещали в фиксатор (10% нейтральный формалин). Далее выполняли стандартный протокол проводки с помощью гистопроцессора карусельного типа Citadel 2000 (Германия), затем заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4—6 мкм готовили на механическом микротоме Finesse 325 («Thermo Scientific», Германия). Гистологические срезы подвергали депарафинированию в ксилоле и окрашивали. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполнено на иммуногистостейнере Leica Bond MAX с применением системы детекции Bond Polymer Refine Detection. ИГХ-реакции провели с использованием первичных моно- и поликлональных антител к CD105, CD34, CD140b, PDGFs, COL I, III и IV типов («Dako Denmark»). Микроскопический и морфометрический анализы гистологических препаратов и их фотографирование производили с помощью светового микроскопа Olympus CX41 (Германия).
Для количественной оценки результатов ИГХ-исследования получали по 10 микрофотографий одного биоптата с помощью программы компьютерного анализа изображений Морфология 5.0 («ВидеоТест», Россия). При этом оценивали площадь иммунопозитивных структур, относили ее к общей площади кадра и рассчитывали показатель относительной площади, в котором и выражали экспрессию исследуемых маркеров. Для каждого наблюдения оценивали коэффициент экспрессии по формуле:
где Б — интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П — доля окрашенных клеток (от 0 до 100%) при каждом значении Б [11].
Использовали прикладные программы Excel, Statistica 10.0. Статистическую обработку проводили по правилам вариационной статистики. Для оценки статистически значимых различий использовали критерий Стьюдента (t), критический уровень значимости (p) принимали меньшим или равным 0,05.
Результаты и обсуждение
ИГХ-исследование экспрессии маркеров разных типов коллагена в зависимости от типа рубца в исследуемых группах показало значительные расхождения в структуре экспрессии всех типов коллагена (табл. 3). При гипертрофическом рубце в основной группе наблюдалось преобладание COL I типа (77,5±5,4%; p<0,05), при этом волокна располагаются продольно, по ходу волокон образуются узловые скопления, имеющие вид местного гиалиноза (рис. 1, см. на цв. вклейке). Волокна COL III типа расположены хоатично в субдермальных слоях кожи. Экспрессия COL IV типа (12,2±1,9%) как фактор васкуляризации уменьшается параллельно увеличению показателя экспрессии COL I типа в сосочковом слое дермы, что следует расценивать как фактор повышенного склерозирования и замуровывания COL I типа. В группе с синдромом НДСТ наблюдается равенство экспрессии показателей COL I и IV типов во всех слоях дермы, при этом COL III типа (51,4±2,1%) является преобладающим типом при гипертрофическом виде рубца (рис. 2, см. на цв. вклейке).
Таблица 3. Количественный показатель площади экспрессии коллагеновых волокон в исследуемых группах, %
| Показатель | Гипертрофический вид рубца | Келоидный вид рубца | Нормотрофический вид рубца | ||
| основная группа | группа с синдромом НДСТ | основная группа | группа с синдромом НДСТ | контрольная группа | |
| COL I типа | 77,5±5,4 | 38,3±1,3 | 67,5±2,6 | 30,1±1,7 | 16,5±3,1 |
| COL III типа | 48,1±4,1 | 51,4±2,1 | 65,3±2,9 | 61,4±1,9 | 13,7±1,6 |
| COL IV типа | 12,2±1,9 | 31,6±2,7 | 84,1±1,9 | 52,3±1,8 | 24,4±2,1 |
Рис. 1. Экспрессия коллагеновых волокон I типа, основная группа исследования, в сосочковом слое дермы наблюдаются перпендикулярный ход волокон эпидермиса (окрашены коричневым цветом) и вакуолизированные кератиноциты.
ИГХ-исследование моноклональными кроличьими антителами к коллагену I типа, докрашивание гематоксилином (микрофотография, ок. 10, об. 400).
Рис. 2. Экспрессия коллагеновых волокон III типа во всех слоях дермы, контрольная группа исследования.
ИГХ-исследование моноклональными кроличьими антителами к коллагену III типа, докрашивание гематоксилином (микрофотография, ок. 10, об. 400).
При келоидной форме рубца показателем развития данного вида рубца в основной группе равнозначно послужили как COL I типа, так и COL III типа, так же как и показатель сосудистой активности — COL IV типа (см. табл. 3). Во всех слоях дермы COL I типа идут параллельными рядами, где по ходу волокон встречаются узловые образования, состоящие из COL III типа. Параллельно с высоким показателем васкуляризации — COL IV типа (рис. 3, см. на цв. вклейке) наблюдаются скопления активно синтезирующих фибробластов, расположенных по ходу волокна. В группе с синдромом НДСТ преобладающим типом волокна является COL III типа (61,4±1,9%) с хатично расположенными волокнами во всех слоях дермы, сопровождаемыми высокоотростчатыми фибробластами (см. табл. 3).
Рис. 3. Экспрессия коллагеновых волокон IV типа в сетчатом слое дермы, основная группа.
ИГХ-исследование моноклональными кроличьими антителами к коллагену IV типа, докрашивание гематоксилином (микрофотография, ок. 10, об. 400).
Количественный показатель экспрессии CD34 и CD105 как факторов адгезии и межклеточного сцепления различен в группах (p<0,05). При гипертрофическом виде рубца преобладание данных показателей, по нашему мнению, свидетельствует о быстром фибриногенезе (35±1,2 и 27±1,4%), что в клинико-морфологическом проявлении наблюдается в основной группе, в которой, помимо активных фибробластов, выявляется большое количество лимфоцитов и макрофагов, являющихся основными источниками фиброгенных цитокинов. Рецептор-β фактора роста выделяют тромбоциты. Проявлением его активности является экспрессия CD140b. В основной группе при гипертрофическом рубце показатель выше, чем в группе с синдромом НДСТ (p<0,05). Показатель PDGFs, который играет роль в заживлении ран и действует как хемоаттрактант для фибробластов, снижен в группе с синдромом НДСТ (41±2,5%) (табл. 4).
Таблица 4. Количественный показатель экспрессии маркеров в исследуемых группах, %
| Показатель экспрессии | Гипертрофический вид рубца | Келоидный вид рубца | Нормотрофический вид рубца | ||
| основная группа | группа с синдромом НДСТ | основная группа | группа с синдромом НДСТ | контрольная группа | |
| CD34 | 35±1,2 | 19±1,4 | 52±1,1 | 76±0,6 | 10±1,6 |
| CD105 | 27±1,4 | 23±2,2 | 66±0,7 | 50±1,2 | 14±1,2 |
| CD140b | 56±1,7 | 34±1,1 | 42±1,3 | 58±0,3 | 18±1,3 |
| PDGFs | 39±2,1 | 41±2,5 | 48±1,4 | 51±2,5 | 16±1,7 |
| p | 0,006 | 0,003 | 0,007 | ||
При келоидной форме рубцевания во всех наблюдаемых группах экспрессия показателей синтетической активности повышена, что характеризует гиперпластический тип фибриногенеза. При этом CD34 и CD105 располагаются во всех слоях дермы, сконцентрированы вокруг фибробластов. В группе с синдромом НДСТ показатели CD34 и CD105 преобладают в сосочковом слое дермы, также наблюдаются узловые участки скопления инфильтрации в слоях эпидермиса. Во всех исследуемых группах экспрессия CD140b, сконцентрированная вокруг сосудов, преобладает в сетчатом слое дермы. А экспрессия PDGFs в обеих группах наблюдения преобладает в сосочковом слое дермы (см. табл. 4).
За прошедшее десятилетие проведено много морфометрических исследований при изучении рубцовых структур [12—14], где несомненную роль в формировании рубца придают фибробластам, маркерам фибриногенеза [15]. При этом ряд ученых отводят важную роль межклеточным соединениям, маркерами которых являются CD34 и CD105. Мы считаем правомерным одновременно изучать маркеры васкуляризации и хемотаксиса фибробластов [16—18], поскольку при увеличении клеточных структур и межклеточного вещества уменьшается и степень васкуляризации. Морфологические исследования демонстрируют, что в рубцах, как правило (90—98%), в разных слоях кожи сочетаются несколько видов рубцовой ткани [19—21]. При этом необходимо оценить значимость различных типов коллагена как в келоидном, так и в гипертрофическом рубце [22—24]. В настоящее время отсутствуют рандомизированные многоцентровые исследования патологических изменений рубцово-измененной кожи, особенно с выделением групп риска [25—27]. При этом нет объективно разработанного алгоритма профилактики патологического фибриногенеза, что и стало целью нашего дальнейшего проекта по изучению патологических рубцов [28, 29].
Таким образом, понимание процесса фибриногенеза, а также изучение этапности активации пусковых механизмов обладает существенной значимостью в разработке алгоритмов профилактических мер воздействия. Необходим индивидуальнный подход патогенетически обоснованного лечения. Такие исследования особенно важны у детей с синдромом НДСТ, которые относятся к группе риска по формированию патологического рубцевания.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.