Введение

Венозные тромбоэмболические осложнения (ВТЭО) относятся к числу полигенных и многофакторных патологий со сложным генезом, связанным как с ген-генными взаимодействиями, так и с взаимодействием генотипа с внешней средой [1]. Открытие в 90-х годах XX века первых маркеров наследственной предрасположенности к венозному тромбозу — дефицита естественных антикоагулянтов и мутаций в генах, кодирующих коагуляционные факторы II и V, положило начало широкому изучению полиморфизма генов, причастных к тромбогенезу [2]. Сегодня известно более 33 локусов, ассоциированных с венозным тромбозом. Показана значимость генов, которые связаны не только с системой коагуляции и фибринолиза, но и с активностью тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, а также с развитием воспаления [3, 4]. S. Lindström и соавт. [4] провели метаанализ данных полногеномного поиска ассоциаций (genome-wide association study — GWAS) по ВТЭО и установили, что наиболее сильные генетические факторы риска венозного тромбоза связаны прежде всего с регуляцией свертывающей системы крови, тогда как другие генетические варианты обладали слабым эффектом. Неоспоримую роль в предрасположенности к ВТЭО, в том числе у лиц молодого возраста, играют мутации в генах факторов свертывания крови II (G20210A) и V (G1691A, FV Leiden). Результаты ряда исследований продемонстрировали увеличение риска ВТЭО при совместном наследовании FII G20210A и FV Leiden, а также при дополнительном воздействии внешних факторов [2, 5].

Существует мнение, что вероятность развития ВТЭО может зависеть от структуры фибринового сгустка и скорости лизиса тромба [6, 7]. Физические свойства венозного тромба, представленного в основном фибрином и эритроцитами, определяются молекулярными характеристиками, включая диаметр фибриновых волокон, их плотность и разветвленность в сгустке, которые зависят в том числе от индивидуальных особенностей процесса сшивания мономеров фибрина [8, 9]. Трехмерная сетка из фибрина действует как основная структура для захвата эритроцитов, тромбоцитов и компонентов плазмы. Прикрепленные факторы свертывания интегрируются в развивающийся тромб и вместе с отложением фибрина регулируют свертывающие и противосвертывающие механизмы [9]. A. Undas и соавт. [10] обнаружили, что для протромбогенного фибринового сгустка характерно более быстрое образование плотной сетки, состоящей из тонких и сильно разветвленных волокон с небольшими порами, менее проницаемых и относительно устойчивых к лизису. В ряде исследований было выявлено, что фибриновые сгустки с такими характеристиками свойственны тяжелому течению венозных тромбоэмболических осложнений [6, 10].

Особенности полиморфизма некоторых генов, кодирующих компоненты системы гемостаза, могут влиять на структуру фибринового сгустка. Комбинации аллельных вариантов таких генов многочисленны, индивидуальны и практически не изучены с точки зрения их возможного влияния на риск развития тромботических осложнений.

Цель настоящего исследования — оценка ген-геных взаимодействий ряда факторов плазменного звена гемостаза для установления комбинаций генов, ассоциированных с повышенным риском ВТЭО у пациентов молодого возраста.

Материал и методы

В исследование были включены 243 пациента в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 37,4±10,5 года), перенесших хотя бы один эпизод ВТЭО, которые проживали в Северо-Западном регионе России: 119 (48,9%) мужчин и 124 (51,1%) женщины. Все пациенты проходили стационарное или амбулаторное лечение в ГБУ «НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе» и/или ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» ФМБА России (ФГБУ «РосНИИГТ» ФМБА России). Контрольную группу (КГ), сопоставимую по полу и возрасту с группой пациентов с ВТЭО, составил 171 здоровый доброволец.

Тромбоз глубоких вен нижних конечностей (ТГВ) диагностировали с помощью компрессионного ультразвукового ангиосканирования. Основными критериями служили визуализация тромба в просвете вены, несжимаемость вены при ее прямой компрессии линейным датчиком и цветовое кодирование венозных сегментов, недоступных для компрессии. Наличие тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) подтверждали при спиральной компьютерной томографии или ангиопульмонографии. Критерием в данном случае являлось обнаружение тромбоэмболов с внутрипросветным заполнением легочных артерий (центральных, сегментарных и субсегментарных).

Всем лицам, включенным в исследование, в лаборатории биохимии ФГБУ «РосНИИГТ» ФМБА России было выполнено молекулярно-генетическое типирование аллельного полиморфизма семи генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза: β-субъединицы фактора I (FI-В -455 G/A), FII (20210 G/A), FV (1691 G/A), FXII (46 C/T), А-субъединицы FXIII (Val34Leu), ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1 -675 4G/5G), тканевого активатора плазминогена TPA (311 п.н. Ins/Del). В качестве материала исследования использовали образцы геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови по методу S. Miller и соавт. [11]. Идентификацию полиморфизма исследуемых генов осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом (метод ПЦР-ПДРФ).

Статистический анализ выполняли с помощью системы KNIME Analytics Platform (v. 4.0.2, KNIME AG, Switzerland), которая относится к классу свободного программного обеспечения (СПО) [12]. Для получения потенциально интересных комбинаций генов были применены алгоритмы классификации J48graft [13], PART [14] и NNge [15] с последующим анализом полученных моделей, а также алгоритм DICE для поиска наиболее частых комбинаций элементов, узел Item Set Finder (Borgeit) [16] с последующей фильтрацией результатов. KNIME активно применяется в медицинских исследованиях, в том числе для анализа генетических данных [17]. Для оценки результатов, а именно ген-генных комбинаций и страт (пол), с точки зрения статистической значимости применяли критерии χ² и точный критерий Фишера. Дополнительно были получены отношение шансов (ОШ) и его 95% доверительный интервал (ДИ) для всех потенциально интересных комбинаций. Построенная модель отличается достаточно высокой чувствительностью (77,78%) и низкой специфичностью (47,95%).

Результаты

Результаты сравнительного анализа распределения генотипов исследуемых генов у пациентов с ВТЭО и в КГ представлены в табл. 1.

Таблица 1. Распространенность исследуемых генотипов у пациентов с ВТЭО и в контрольной группе (КГ), %

Примечание. * — 64 (37,4%) участника КГ не проходили типирование на полиморфизм гена FXIII34 Val/Val, n=107; ** — 2 (1,2%) участника КГ не проходили типирование на полиморфизм гена FXII 46 C/Т, n=169.

Был выявлен ряд статистически значимых различий между группами. Так, гетерозиготный генотип 20210 G/A гена фактора II встречали в 8 раз чаще среди пациентов с ВТЭО по сравнению с КГ (9,5% против 1,2% соответственно; ОШ 8,8; 95% ДИ 2,1—37,9; p=0,001). Доля гетерозиготных носителей Лейденской мутации в гене фактора V среди пациентов с ВТЭО более чем в 3 раза превышала таковую у здоровых КГ (14,4% против 4,7% соответственно; ОШ 3,7; 95% ДИ 1,7—8,1; p=0,003). Кроме того, в группе с ВТЭО также было отмечено заметное увеличение частоты гомозиготного варианта 34 Leu/Leu А-субъединицы фактора XIII (8,2% против 5,6% в КГ, ОШ=1,5; 95% ДИ 0,9—40,0; p=0,14). В то же время гомозиготный генотип FI -455 A/A, напротив, в 2 раза реже наблюдали среди пациентов с тромбозом (4,5% против 8,2% в КГ; ОШ 0,6; 95% ДИ 0,3—1,3; p=0,21). Однако различия в распределении генотипов факторов I и XIII между группой ВТЭО и КГ не были статистически значимыми.

Для установления потенциально значимых комбинаций генов, причастных к риску ВТЭО, были использованы алгоритмы классификации с построением дерева решений. В результате сложного, многоступенчатого анализа, в том числе со стратификацией по полу, было выявлено 15 комбинаций изучаемых генов, ассоциированных как с риском тромбоза, так и с протективным эффектом. В настоящей работе представлены только комбинации с высокой статистической значимостью (табл. 2).

Таблица 2. Распространенность ген-генных комбинаций, являющихся потенциальными факторами риска ВТЭО, %

Примечание. Ж — женщины.

Необходимо отметить, что во всех генотипических сочетаниях, обнаруженных в общей группе пациентов с ВТЭО, присутствовал гетерозиготный вариант FXIII 34 Val/Leu. Такие комбинации, как «FXIII 34 Val/Leu + FI -455 G/A + FII 20210 G/G» (ОШ 2,2; 95% ДИ 1,2—4,2; p=0,01), «FXIII 34 Val/Leu + FI -455 G/A» (ОШ 2,3; 95% ДИ 1,2—4,3; p=0,01) в 2 раза чаще встречались среди пациентов с венозным тромбозом, чем в КГ. Кроме того, в общей группе пациентов были выявлены любопытные сочетания варианта FXIII 34 Val/Leu с гомозиготным генотипом PAI-1 4G/4G (18,1% против 9,4% в КГ; ОШ 2,1; 95% ДИ 1,2—3,9; p=0,016) и гетерозиготным генотипом FXII 46 C/T (17,7% против 8,8% в КГ; ОШ 2,2; 95% ДИ 1,2—4,2; p=0,016).

В результате проведенного анализа в группе пациентов с ВТЭО были установлены гендерные различия в частоте выявления некоторых генов и их комбинаций. Так, наибольшее ОШ риска ВТЭО у женщин наблюдали для сочетания генетических вариантов «FI -455 G/G + FXIII 34 Val/Val + TPA Del/Ins» (15,3% против 3,3% в КГ; ОШ 5,3; 95% ДИ 1,2—23,7; p=0,014). Гетерозиготный вариант FXIII 34 Val/Leu был независимо ассоциирован с риском ВТЭО у женщин (40,3% против 24,6% в КГ; ОШ 2,1; 95% ДИ 1,0—4,1; p=0,049). Следует подчеркнуть, что у мужчин наличие гетерозиготного варианта FXII 46 C/T имело протективный эффект от риска ВТЭО (35,2% против 50,2% в КГ; ОШ 0,5; 95% ДИ 0,3—1,0; p=0,04).

Обсуждение

Несмотря на расширение спектра генетических маркеров, для которых показана ассоциация с гиперкоагуляционными состояниями, молекулярные биохимические механизмы, приводящие к повышенной вероятности тромбообразования в венозном русле, остаются недостаточно понятными [7]. Существенное влияние на риск развития ВТЭО могут оказывать аномальные структурные свойства фибринового сгустка, которые, в свою очередь, во многом зависят от аллельного полиморфизма генов плазменных факторов гемостаза, участвующих в процессах образования тромба и его лизиса [6, 7]. В исследованиях ряда авторов было продемонстрировано, что у пациентов, имевших в анамнезе ВТЭО, фибриновый сгусток характеризовался меньшей плотностью, низкой проницаемостью и более длительным временем лизиса [6]. Подобные результаты также наблюдали у практически здоровых родственников пациентов с ВТЭО, что указывает на общие наследственные причины аномальной структуры образующегося в результате активации системы гемостаза фибринового сгустка [10].

Известно, что наличие мутации FII G20210A связано с повышенным уровнем циркулирующего протромбина, что приводит к усилению образования тромбина. Роль этой мутации в риске ВТЭО подтверждена во многих работах [2, 7]. В настоящем исследовании наличие гетерозиготного аллеля FII 20210A у пациентов до 45 лет увеличивало риск ВТЭО почти в 9 раз по сравнению с КГ (ОШ 8,8; p=0,001). Другой известный генетический маркер — Лейденская мутация (FV Leiden, G1691A), отвечающая за формирование резистентности к активированному протеину С и также приводящая к усилению генерации тромбина, — связан примерно с 5-кратным увеличением риска венозного тромбоза [18], что также согласуется с полученными в настоящем исследовании результатами (ОШ 3,7; p=0,003). Однако, несмотря на высокую значимость указанных мутаций в патогенезе ВТЭО, суммарная частота их обнаружения в обследованной группе составила всего 24,7%, что указывает на существование и необходимость поиска иных генетических факторов риска тромбозов в венозном русле.

Структура фибринового сгустка и его устойчивость к фибринолизу зависят не только от уровня и активности тромбина, но также от свойств фибринового волокна и фибринолитического потенциала [8, 9]. В ходе настоящего исследования был проведен анализ ген-генных взаимодействий ряда аллельных вариантов генов, кодирующих плазменные компоненты гемостаза, в группе пациентов с ранним дебютом ВТЭО, в результате которого были выявлены значимые различия с КГ. Было обнаружено пять генотипических сочетаний, включающих как варианты, кодирующие компоненты фибринолиза (PAI-1 4G/5G, TPA Del/Ins), так и варианты факторов, формирующих фибриновую сеть (FI -455 G/A и FXIII 34 Val/Leu). При этом каждая из выявленных комбинаций характеризовалась высокой статистической значимостью различия частоты встречаемости у пациентов с ВТЭО и в здоровой популяции в 2—5 раз.

Чаще всего в разных ген-генных комбинациях встречали гетерозиготный генотип FXIII 34 Val/Leu. Независимо от пола пациентов, наличие данного варианта FXIII приводило к существенному увеличению риска ВТЭО в молодом возрасте в случае сочетания с генотипами, ассоциированными с повышением уровня фибриногена (FI -455 G/A) и/или снижением фибринолитической активности (FXII 46 C/T, PAI-1 -675 4G/4G). Известно, что полиморфизм FXIII Val34Leu приводит к увеличению скорости образования поперечных сшивок между нитями фибрина, влияя на структуру фибринового волокна и конечного сгустка [9]. Интересно, что для минорного варианта фактора XIII (34Leu), по данным R. Ariëns и соавт. [19], характерно образование более тонких фибриновых волокон и менее пористой структуры сгустка. Таким образом, выявленные ген-генные комбинации косвенно подтверждают патологический характер сопряженности биохимических процессов, приводящих к повышенному тромбообразованию и гипофибринолизу. Отдельно следует отметить, что гетерозиготный генотип FXIII в настоящем исследовании был независимо связан с риском ВТЭО у женщин (ОШ 2,1; p=0,049). Интересно, что в нашей предыдущей работе подобные результаты были получены в отношении гомозиготного варианта 34Leu [20].

Тем не менее обнаруженные нами ген-генные комбинации не всегда позволяют сделать однозначный вывод о роли того или иного аллельного варианта (или их сочетаний) в патогенезе ВТЭО. Так, в группе молодых пациенток нами было выявлено почти 5-кратное увеличение доли лиц по сравнению с контрольной группой, имевших сочетание гетерозиготного генотипа ТРА (Del/Ins) с «нормальными» генотипами факторов I (-455 G/G) и XIII (Val/Val) (ОШ 5,34; p=0,014). Известно, что наличие в генотипе варианта Ins гена TPA фенотипически ассоциируется с более высокой скоростью высвобождения этого фактора эндотелиальными клетками и, следовательно, с усилением фибринолиза [21]. В то же время в ряде исследований было показано, что повышение уровня TPA в плазме крови может считаться маркером риска тромбоза, в особенности в артериальном русле [22, 23]. W. Hooper и соавт. [24] обнаружили существенное увеличение риска ВТЭО на фоне беременности у женщин с генотипом «TPA Ins/Ins». Также любопытные результаты были получены нами и в отношении полиморфизма гена FXII (46C/T), который ассоциирован со снижением уровня и активности данного фактора в плазме крови [25]. Дефицит FXII приводит к нарушению фибринолиза и, как следствие, ассоциирован с риском развития тромбоза [25]. Результаты исследования E. Cochery-Nouvellon и соавт. [26] продемонстрировали 6-кратное увеличение риска ВТЭО у беременных женщин при гомозиготном носительстве аллеля 46T (ОШ 6,0; p=0,001). В настоящем исследовании гетерозиготный генотип FXII 46 C/T характеризовался защитным эффектом от ВТЭО у мужчин (ОШ 0,5; p=0,04), тогда как сочетание гетерозиготных вариантов FXII и FXIII в 2 раза чаще выявляли у молодых пациентов с ВТЭО, независимо от их пола (ОШ 2,2; p=0,01).

В отличие от полиморфизма генов ТРА и FXII роль генетической вариабельности PAI-1 в патогенезе ВТЭО не вызывает сомнений. Аллельный вариант PAI-1 -675 4G связан с повышенной экспрессией гена и, следовательно, приводит к увеличению уровня PAI-1 в крови и торможению фибринолиза [27]. Несколько крупных метаанализов показали, что носительство варианта 4G ассоциировано с риском ВТЭО [27, 28]. В настоящем исследовании не было найдено различий в распределении генотипов PAI-1 между пациентами с ВТЭО и лицами КГ, однако сочетание гомозиготного варианта PAI-1 4G/4G с гетерозиготным генотипом FXIII Val34Leu увеличивало риск венозного тромбоза у лиц молодого возраста в 2 раза (ОШ 2,1; p=0,016),

Ограничения исследования. К ограничениям настоящего исследования следует отнести относительно небольшое число пациентов, а также отсутствие анализа внешних факторов и других маркеров наследственной тромбофилии, причастных к гиперкоагуляционным состояниям. Вместе с тем, хотя полученные в ходе наблюдения модели еще не имеют достаточной прогностической ценности, даже на данном этапе исследования ясно, что анализ их структуры может дать в будущем полезную информацию о формировании взаимосвязей и признаков изучаемых генов, ассоциированных как с риском тромбоза, так и с протективным эффектом.

Заключение

Помимо мутаций в генах факторов II и V значительное влияние на риск развития ВТЭО оказывает полиморфизм Val34Leu фактора XIII, особенно при сочетании с носительством неблагоприятных вариантов FI -455 G/A, FXII 46 C/T, PAI-1 4G/4G. Выявленные комбинации аллельных вариантов генов, участвующих в формировании фибринового сгустка, могут косвенно объяснять его аномальную структуру и причастность к клиническому венозному тромбозу. Независимым фактором риска ВТЭО у женщин служит полиморфизм FXIII Val34Leu, тогда как для мужчин наличие в генотипе FXII 46 C/T имело значимый защитный эффект от ВТЭО.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.В. Чечулова, С.И. Капустин, В.В. Сорока

Сбор и обработка материала — А.В. Чечулова, С.И. Капустин, В.Е. Солдатенков, В.Д. Каргин, Л.П. Папаян, П.М. Малкова

Статистическая обработка данных — М.И. Гальченко

Написание текста — А.В. Чечулова

Редактирование — С.И. Капустин, В.В. Сорока

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.