В последние годы все шире обсуждается роль дисфункции эндотелия в развитии различных заболеваний сосудов [1—4]. Переосмысление взглядов на этиологию и патогенез заболеваний венозной системы с позиции эндотелиальной дисфункции не отрицает сформулированных факторов риска возникновения венозных тромбоэмболических осложнений, однако позволяет трактовать их по-иному, находя новые причинно-следственные связи. Теория дисфункции эндотелия многогранна, обсуждает множество вероятных механизмов повреждения эндотелиоцитов, таких как активированные лейкоциты, свободные радикалы и продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), пероксинитрит (NOOO^–), гипопродукция оксида азота (II) (NO), вследствие воздействия различных факторов [5].

Представление об эндотелиальной дисфункции как о возможной причине заболеваний, в том числе и венозной системы, заставляет исследователей искать средства воздействия на этот патологический процесс. К числу фармакологических средств, которые могут оказывать такое влияние, можно отнести микронизированную очищенную фракцию флавоноидов (МОФФ). Этот флеботропный препарат является препаратом выбора в симптоматическом и патогенетическом лечении венозной патологии [6—8].

Цель настоящего исследования — изучение эндотелиотропных эффектов МОФФ при моделировании различных заболеваний венозной системы в эксперименте.

Исследование проведено на 140 крысах линии Wistar массой 250—350 г. Все исследования выполняли в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и приказе Минздрава СССР № 742 от 13.11.84.

Животные были разделены на четыре группы.

В 1-й группе (экспериментальный тромбоз глубоких вен — ТГВ) животным (n=35) под наркозом после срединной лапаротомии выполняли перевязку правой общей подвздошной вены и вводили дистальнее лигатуры 0,3 мл подогретого до 37—37,5 °С раствора тромбина (40 ЕД/кг) [9]. C 3-х суток от момента оперативного вмешательства и на протяжении 6 мес животным энтеральным путем вводили водную суспензию МОФФ в дозе 100 мг/кг в сутки. Определение биохимических показателей функционального состояния эндотелия (ФСЭ) осуществляли на 10-е сутки, в 1, 2, 3 и 6-й месяцы с момента оперативного вмешательства, проводили морфологическое исследование венозной стенки.

Во 2-й группе (экспериментальная посттромботическая болезнь — ПТБ) животным (n=35) под наркозом после срединной лапаротомии выполняли аналогичное оперативное вмешательство. C 31-х суток от момента лигирования вены и на протяжении 6 мес животным энтеральным путем вводили водную суспензию МОФФ в дозе 100 мг/кг в сутки. Определение биохимических показателей ФСЭ и антиоксидантного статуса осуществляли в 1, 2, 3 и 6-й месяцы с момента операции, проводили морфологическое исследование венозной стенки.

В 3-й группе (L-NAME-индуцированная эндотелиальная дисфункция) животным (n=35) проводили внутрибрюшинное введение N-нитро-L-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг в сутки в течение 7 сут [10]. C 8-х суток от начала эксперимента и на протяжении 6 мес животным энтеральным путем вводили водную суспензию МОФФ в дозе 100 мг/кг в сутки. Определяли биохимические показатели ФСЭ и антиоксидантного статуса на 8-е сутки, в 1, 2, 3 и 6-й месяцы от момента начала эксперимента, проводили морфологическое исследование венозной стенки.

В 4-й (контрольная) группе животным (n=35) по описанной выше методике моделировали венозный тромбоз. МОФФ не вводили. Определяли те же показатели, что и в других группах, на 10-е сутки, 1, 2, 3 и 6-й месяцы от момента начала эксперимента и проводили морфологическое исследование венозной стенки.

Забор крови у животных осуществлялся из нижней полой вены после ре- и лапаротомии под наркозом при соблюдении правил асептики. Выведение животных из эксперимента в количестве 7 особей производили в указанные для каждой группы сроки путем внутривенной передозировки раствором сернокислой магнезии. Эвтаназию животных на протяжении периода исследования осуществляли ввиду необходимости определения исследуемых показателей, для чего требуется около 5 мл крови от особи, что само по себе является фатальной кровопотерей для животного, и необходимости морфологического исследования в указанные для каждой из групп временны́е интервалы. Выделяли комплекс брюшная аорта — общие подвздошные артерии — нижняя полая вена — общие подвздошные вены для проведения гистологического исследования в зоне моделирования тромбоза. Выделенный сосудистый пучок фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (фосфатный буфер, pH 7,2—7,4), обезвоживали в серии этанолов возрастающей концентрации с применением изопропанола, заливали в парафин. Готовили тотальные серии срезов (10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином («Biovitrum», Россия). Гистологические срезы также окрашивали пикрофуксином по Ван-Гизону и по методу Маллори по общепринятой методике.

Морфологическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DMI 4000 B с видеозахватом камерой Leica.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в гемолизате по методу, основанному на реакции окисления кверцетина [11]. Содержание малонового диальдегида (МДА) в гемолизате выявляли по методу, основанному на реакции с тиобарбитуровой кислотой [12]. Определение СОД и МДА выполнено на фотометре КФК-3−01-ЗОМЗ. Уровень глутатионпероксидазы (ГП) измеряли в гемолизате по методу В.З. Ланкина [13] на спектрофотометре Humalaizer 2000. Содержание метаболитов NO определяли в сыворотке крови на ИФА-анализаторе Stat Fax 2100 по методике В.А. Метельской [14].

Содержание индуцибельной синтазы окси-да азота (II) iNOS в плазме крови выявляли методом иммуноферментного анализа на ИФА-анализаторе Stat Fax 3200 («Awareness Technology, Inc.»).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью критериев Шапиро—Уилка, Ньюмена—Кейсла, теста Крускала—Уоллиса, критериев Стьюдента, Манна—Уитни путем определения среднего арифметического значения, стандартной ошибки. Для данных, имеющих распределение, отличное от нормального, рассчитывали медиану (Me), верхний (Q25) и нижний (Q75) квартили.

Колебания основных биохимических показателей ФСЭ, определявшихся в исследовании, позволяют говорить о том, что развитие ТГВ, ПТБ и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции влияет на ФСЭ (табл. 1—8). Во всех группах после воспроизведения указанных моделей отмечаются сопоставимые в количественном отношении результаты. Наблюдается значимое снижение содержания метаболитов оксида азота (II), повышение уровня МДА и, как следствие, компенсаторная активация антиоксидантной системы, проявляющаяся в увеличении уровня ГП и СОД.

Таким образом, применение МОФФ вызывает значимое увеличение синтеза NO и снижение уровня МДА, Г.и СОД во всех группах на протяжении эксперимента, что говорит о наличии у препарата эндотелиотропного эффекта. Изучаемые показатели достигли своих исходных значений к 1-му месяцу наблюдения и оставались на этом же уровне на протяжении всего периода исследования. Активность СОД и ГП на фоне применения МОФФ снижается, возможно, вследствие уменьшения содержания продуктов ПОЛ, что является предпосылкой для реализации положительных эффектов NO, однако это снижение достигло уровня значимости не во всех группах. Парадоксально выглядит тот факт, что на фоне увеличения содержания iNOS — самого активного представителя NO-синтаз происходит довольно выраженное снижения содержание метаболитов NO. Этот факт объясняется тем, что в условиях оксидативного стресса происходит взаимодействие NO со свободными радикалами, в том числе с активными формами кислорода, с образованием пероксинитрита, который обладает высокой нитрозилирующей активностью. В результате данного процесса происходит нитрозилирование белков и липопротеинов плазмы крови и биологических мембран. Таким образом, включение эндогенного NO в патофизиологические процессы создает его относительный дефицит в сыворотке крови, и он перестает выполнять свои основные физиологические функции. Подобную картину наблюдали в контрольной группе на протяжении всего исследования.

При гистологическом исследовании на 10-е сутки от начала эксперимента в 1-й и контрольной группах (рис. 1) морфологические изменения были представлены выраженными полями экcсудативного воспаления вокруг стенки сосуда с явлениями дезорганизации соединительной ткани, в которой преобладали деструктивные процессы. Стенка вены была неравномерной толщины, с воспалительной инфильтрацией в адвентиции и периваскулярно, в просвете находились гемолизированные и обесцвеченные эритроциты с фибриновой базофильной сетью. Массы фибрина и стенка вены были связаны грануляционной тканью, в последней наблюдали пролиферацию фибробластов и очаги геморрагической инфильтрации.

Во 2-й группе через 6 мес после операции при гистологическом исследовании: стенка с хорошо развитым мышечным слоем, интима неравномерно утолщена, выстлана прерывистым эндотелием, нередко его расположение частоколообразное, с признаками пролиферации. В просвете некоторых сосудов определяются остатки фибринозно-эритроцитарных тромбов, преимущественно с пристеночным их расположением, очагами реваскуляризации (рис. 2, а). Адвентиция и средняя оболочка с неравномерным утолщением и развитием vasa vasorum. В адвентиции рыхлая инфильтрация, преобладают пикринофильные волокна, единичные макрофаги с признаками фагоцитарной активности, очаги резорбции гемосидерина. В зоне наложения лигатуры по-прежнему сохраняется макрофагальная и эпителиоидно-клеточная активность, очаговые поля коллагена с преобладанием фуксинофильных волокон, ангиоматоз.

В группе контроля (см. рис. 2, б) стенка вены с хорошо развитой мышечной оболочкой, интима утолщена, базальная мембрана широкая, плотная, местами отслоена, в просвете фибринозно-эритроцитарный тромб с пристеночной организацией и реваскуляризацией, в стенке неравномерная воспалительная инфильтрация в интиме и адвентиции, в адвентиции периваскулярно, в артерии отек интимы, мелкие сосуды малокровные. В адвентиции рыхлая инфильтрация полиморфно-ядерными лейкоцитами, мелкие сосуды неравномерно полнокровные, окружающая клетчатка умеренно отечная, с ангиоматозом, артерия обычного строения.

Во 2-й группе морфологическая картина (рис. 3, а) в момент создания модели до медикаментозной поддержки представлена массивным периваскулярным интерстициальным отеком, с участками фибриноидного пропитывания вплоть до фибриноидного некроза, что сопоставимо с данными группы контроля в аналогичный срок.

Выявлена периваскулярно расположенная очагово-диффузная воспалительная инфильтрация, с преобладанием мононуклеаров в экссудате. Стенка вены неравномерной толщины, с очаговой воспалительной инфильтрацией в адвентиции, в просвете гемолизированные и обесцвеченные эритроциты с фибриновой базофильной сетью, фибриноидные массы. По периферии сосуда, вокруг адвентиции визуализируются поля зерен гемосидерина как свободно лежащие, так и в единичных гемосидерофагах. В просвете вен видны организованные фибринозно-эритроцитарные тромбы, преимущественно с частичной обтурацией просвета (рис. 4).

Морфологическая картина в 3-й группе (L-NAME-индуцированная эндотелиальная дифункция (рис. 5, а), при световой микроскопии не отличается какими-либо патогномоничными изменениями, характерными для данной модели. Имеются поля массивного интерстициального отека, выраженные поля дезорганизации эндотелия, заключающиеся в слущивании эндотелия, увеличение межэндотелиальных промежутков и очаги фибриноидного набухания и некроза, утолщение стенки и коллагенолизис. Экссудативное воспаление в данной группе не преобладало и носило преимущественно серозный или интерстициальный характер с распределением экссудата очагово, преимущественно в адвентиции.

В результате коррекции L-NAME-индуцированной патологии МОФФ (рис. 6, а) происходит восстановление целостности эндотелия, некоторые эндотелиоциты с картиной пролиферативной активности, периваскулярный отек и нарушения соединительнотканного и коллагенового каркаса претерпевают ряд изменений, направленных на восстановление поврежденного волокнистого каркаса, поля ангиогенеза, преимущественно в адвентиции, полнокровия сосудов окружающей клетчатки.

Таким образом, в группах ТГВ, ПТБ и контроля отмечены выраженные структурные нарушения венозной стенки, в контексте работы являясь морфологическими проявлениями эндотелиальной дисфункции. В группе L-NAME подобные изменения отсутствовали, при этом наблюдались биохимические сдвиги, что говорит об обратимости последствий данной экспериментальной модели.

МОФФ оказывает положительное действие на морфологические сдвиги. Это заключается в снижении интерстициального отека, уменьшении лейкоцитарной инфильтрации, частичном регрессе склеротического процесса и восстановлении гладкомышечных клеток. Однако степень выраженности подобного рода структурного регресса варьирует среди всех групп животных. В группе контроля, где МОФФ не применяли, процессы репарации выражены в наименьшей степени. В группе L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции структурные изменения венозной стенки были незначительными, однако и у животных этой группы было выявлено положительное действие МОФФ. Выраженный регресс структурных нарушений отмечен в группе экспериментального ТГВ, где препарат применяли с 3-х суток от момента начала эксперимента. Во 2-й группе подобный регресс был менее выражен, что, по-видимому, связано с более длительным периодом от момента тромбоза до начала применения МОФФ.

Конфликт интересов: Компания «Сервье» предоставила для проведения исследования оборудование и программное обеспечение. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов при определении структуры исследования, сборе, анализе и интерпретации данных, написании статьи, а также при принятии решения опубликовать полученные результаты.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.Е., И.А., А.Н., А.С.

Сбор и обработка материала — А.Н., А.С., М.В., С.Р.

Статистическая обработка — А.Н., М.В.

Написание текста — А.Н., И.А.

Редактирование — Р.Е., И.А.