Стратегия лечения венозных тромбозов подразумевает восстановление кровотока по магистральным сосудам, предупреждение эмболии легочной артерии и развития посттромботической болезни [1]. Для этого используют консервативные (медикаментозные), хирургические и эндоваскулярные методы лечения, что позволяет эффективно восстанавливать просвет тромбированных периферических сосудов и кровоток в них путем ферментативного или механического удаления тромбов из просвета сосудов. В результате наблюдается уменьшение числа жизнеопасных осложнений и значительное снижение летальности.

Однако проведение вышеописанных процедур имеет ряд ограничений: сроки начала заболевания (для тромболитической терапии, катетерной тромбэктомии), наличие сопутствующих заболеваний (для тромболизиса), высокая частота процедурных осложнений (реолитическая тромбэктомия). Вышеизложенное определяет необходимость разработки новых методов лечения тромбоза, использование которых позволило бы преодолеть недостатки ныне существующих. В последние годы во всем мире проводятся интенсивные исследования по разработке систем локальной доставки (Drug Delivery Systems  — DDSs) тромболитиков к месту тромбоза [2]. Применение нанотехнологий для систем доставки лекарственных средств основано на обеспечении целенаправленного поступления лекарственных веществ исключительно в определенные зоны органов и тканей, что повышает эффективность лечения и минимизирует побочные эффекты. В качестве DDSs могут быть использованы различные наночастицы на основе биодеградабельных полимеров, полисахаридов, природных белков, а также липосом [3]. Липосомы представляют собой микроскопические заполненные жидкостью сферические частицы, схожие с клеточными мембранами [4]. В случае пектинатных микросфер инкапсуляция препаратов и их замедленное высвобождение в органах и тканях возможны благодаря способности гидрофильного полимера пектина к образованию геля в водной среде, увеличивающего свою плотность при сшивке с хлоридом кальция [5]. Создание таких «наноконтейнеров» и их использование в качестве носителей лекарственных препаратов позволяет достичь существенного усиления тромболизиса за счет увеличения пенетрации активатора плазминогена в тромботические массы [2].

Анализ изученных нами источников литературы показал, что фундаментальных исследований, посвящeнных изучению липосом и пектинатных микросфер для лечения тромбозов, не проводилось.

Цель исследования — провести сравнительную оценку эффективности тромболизиса капсулированной (пектинатные и липосомальные наночастицы, содержащие стрептокиназу) и некапсулированной стрептокиназой в эксперименте.

Пектинатные и липосомальные наночастицы получали в лаборатории химии поверхности тонких пленок ГНУ ИХНМ НАН Беларуси. Пектинатные микросферы формировали эмульсионным методом. Для этого в 1 г 1,5—3% раствора пектина растворяли 10 мг бычьего сывороточного альбумина или 20 мг препарата стрептокиназы, диспергировали в 8 г изооктана, содержащего 1,8 мг Спан 80, 1,8 мг Твин 85, и подвергали обработке низкочастотным ультразвуком (22 кГц) в течение 2 мин. После этого смесь желировали эмульсией хлорида кальция (1,2—6,5% внутривенно), также содержащей поверхностно-активные вещества. Полученные микросферы отмывали изооктаном и гексаном и лиофилизировали.

Для получения липосом смесь фосфохолина и холестерина в молярном соотношении 2:1 растворяли в хлороформе, после чего выпаривали растворитель до получения однородной пленки. Затем добавляли 40 мм водный раствор глюкозы и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1—2 мин. Полученную суспензию лиофилизировали. Включение стрептокиназы проводили после лиофилизации липосом. Для этого добавляли раствор стрептокиназы из расчета 22,5 тыс. ед. на 1 мг липидов, проводили 3 цикла «замораживания—оттаивания» и снова лиофилизировали.

Экспериментальную часть выполнили на базе патофизиологической группы НИЛ БелМАПО в стандартных условиях операционного блока вивария. В ходе эксперимента руководствовались приказом Минвуза СССР № 742 от 13.11.84 «Об утверждении правил работ с использованием экспериментальных животных», «Правилами работы с экспериментальными животными», требованиями, регламентирующими работу с экспериментальными животными, а также стандартами American Heart Associations «Guidelines for the Use of Animal in Research» и Guide for the core and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Revised, 1996) [6]. Для воспроизведения венозного тромбоза использовали 40 рандомбредных крыс самцов массой 320—350 г (четыре группы, по 10 особей в группе). Все манипуляции выполняли на наркотизированных и зафиксированных животных. Венозный тромб моделировали путем наложения лигатур на участок выделенной яремной вены длиной 1—1,5 см. Введение тромбина (0,1 мл раствора тромбина, 50 ед. в 1 мл) и наложение дистальной лигатуры проводили практически одновременно. Участок вены между лигатурами насколько раз пережимали зажимом, чтобы вызвать дополнительное травмирование сосуда. За проксимальной лигатурой синтетической нитью 4−0 на атравматичной игле накладывали V-образный фильтр, препятствующий миграции тромба, но не нарушающий кровоток. Через 30 мин лигатуры развязывали, при этом кровоток восстанавливался, в сосуде четко просматривалось место образования и прикрепления тромба. Через 10 мин после восстановления кровотока в хвостовую вену 30 крысам вводили раствор стрептокиназы: чистый и содержащийся в липосомах и пектинатах из расчета 150 тыс. ед. на 1 кг массы животного на фоне введения человеческого плазминогена (необходимого для нивелирования видовой специфичности) в дозе из расчета 0,66 мг на 1 кг массы крысы. Тромбированные вены для морфологических исследований забирали через 1,5 ч после введения препаратов. Фиксированный в формалине материал проводили по стандартному протоколу и заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4—5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, методом MSB [7] для выявления фибрина. Срезы для исследования отбирали по методу бесповторного случайного отбора [8]. Участок вены с тромбом (1—1,5 см) рассекали на пластины толщиной 5 мм в плоскостях, перпендикулярных сосуду. Из каждой пластины готовили 1 парафиновый блок, на микротоме готовили серии срезов, каждый десятый из которых брали для исследования. Все забранные срезы подвергались скрининговому микроскопированию при окрашивании гематоксилином и эозином и на фибрин (MSB), после чего для морфометрического исследования отбирали срезы, имевшие компоненты тромба, без разрывов сосудистой стенки.

Для иммуногистохимического (ИГХ) типирования и оценки степени повреждения эндотелиальных клеток (ЭК) использовали антитела к фактору Виллебранда (ФВ). Выраженная экспрессия ФВ свидетельствовала о повреждении/дисфункции эндотелия, адгезии тромбоцитов к субэндотелиальному слою, их агрегации. Изучение препаратов и изготовление микрофотографий проводили с помощью светового микроскопа Axio Imager (ZEISS). Морфометрию осуществляли с помощью вычислительной системы обработки и анализа изображения Leica-Qwin на микропрепаратах сосудов, окрашенных методом MSB. Определяли площадь тромба (S1), площадь просвета сосуда (S2), коэффициент тромболизиса рассчитывали по отношению суммарной площади фрагментов тромба в просвете вены к площади просвета (S1/S2). Уменьшение коэффициента тромболизиса свидетельствовало о более интенсивном лизисе тромба. Измерения проводили при увеличении 50 по всей площади каждого среза сосуда. Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для проверки нормальности распределения данных использовали метод Колмогорова—Смирнова, а также показатели эксцесса и асимметрии. Различия между выборками оценивали, используя U-тест Манна—Уитни для парного сравнения групп. Значимыми считали различия при р<0,05. Представление результатов: Me (медиана); 25-й; 75-й процентили [9].

У всех контрольных животных (n=10) с экспериментальным тромбозом вен без лечения наблюдалось формирование обтурирующих (преимущественно) или субобтурирующих красных тромбов с очагами фибрина (рис. 1).

В большинстве наблюдений отмечали лизис тромба, центральная зона просвета вены чаще была свободна, иногда заполнена эритроцитами, образующими агрегаты, фибрин визуализировали во всех случаях в виде мелких локусов или очагов, в тромботических фрагментах или субинтимально (рис. 2, а). В одном наблюдении отмечали минимальный лизис, в просвете вены визуализировали крупный фрагмент тромба, лежащий свободно и состоящий из плотно спаянных эритроцитов, с узкой полоской фибрина по периферии тромба и очагами молодого фибрина в центральной его части (см. рис. 2, б). Эндотелиальные клетки интимы, набухшие или кариохромные, интенсивно прокрашивались антителом к фактору Виллебранда, что свидетельствовало об их повышенной активности.

Во всех наблюдениях отмечали лизис тромба, в большинстве случаев — полный фибринолиз (фибрин отсутствовал), центральная часть просвета вены была свободна, периферия просвета заполнена свободно лежащими эритроцитами или их мелкими агрегатами, иногда с вкраплениями клеток белой крови (рис. 3, а, б). В 2 наблюдениях в просвете вены визуализировали эритроцитные сгустки или отдельные эритроциты, наблюдали небольшие локусы молодого фибрина, расположенного субинтимально, или мелкие очаги зрелого фибрина в отдельных фрагментах тромба (см. рис. 3, в). При ИГХ-окрашива-нии с антителами к ФВ клетки эндотелия были без выраженных патологических изменений, единичные клетки были набухшие с интенсивным прокрашиванием цитоплазмы.

Во всех наблюдениях отмечали лизис тромба. В центре просвета вены обнаруживали кровь: эритроциты по большей части располагались свободно или были объединены в небольшие группы с незначительной примесью лейкоцитов, фибрин в минимальных количествах визуализировали субинтимально (рис. 4, а). В одном случае в просвете вены сохранялся тромб с признаками лизирования, содержащий фибрин по периферии и в центре (см. рис. 4, б). При ИГХ-окрашивании ЭК — нормохромные, синусоидного типа, без признаков гиперактивации.

Таким образом, проведенные морфологические исследования показали, что при использовании в качестве тромболитика липосомальной формы стрептокиназы через 1,5 ч воздействия отмечался наиболее полный тромболизис во всех наблюдениях. В большинстве случаев фибрин при гистохимической окраске не визуализировали, изредка отмечали наличие зрелого фибрина субинтимально или по периферии эритроцитных сгустков. При использовании пектинатных наноконтейнеров и некапсулированной стрептокиназы через 1,5 ч воздействия во всех наблюдениях отмечали тромболизис, фибрин визуализировали во всех случаях в тромботических фрагментах или субинтимально.

Экспрессия ФВ была представлена цитоплазматическим окрашиванием различной степени интенсивности — от светло-коричневого до темно-коричневого окрашивания эндотелиальных клеток интимы вен, а также в виде преимущественно умеренного окрашивания тромбоцитов. Отмечалось слабое окрашивание ФВ цитоплазмы клеток эндотелия тромбированной вены у крыс 3-й группы, умеренное и в единичных клетках выраженное окрашивание цитоплазмы ЭК у животных 2-й группы, интенсивное окрашивание цитоплазмы ЭК — в 1-й группе (рис. 5).

При количественной оценке тромболизиса (см. таблицу) лучшие результаты получены при использовании липосомальной капсулированной формы стрептокиназы по сравнению с некапсулированной стрептокиназой (0,5 и 1,03 соответственно; p<0,05). При использовании пектинатной формы стрептокиназы прослеживалась тенденция к уменьшению коэффициента тромболизиса по сравнению с нативной стрептокиназой, однако статистически значимых различий не отмечалось (0,7 и 1,03; р>0,05).

Тромболизис в венах всех экспериментальных животных после применения капсулированной стрептокиназы отмечается через 1,5 ч воздействия. Использование в качестве тромболитика липосомальной формы стрептокиназы обеспечивает полный лизис фибринового компонента тромба в 80% наблюдений, при использовании нативной стрептокиназы и пектинатных форм стрептокиназы фрагменты фибрина сохраняются в 100% наблюдений.

Количественная оценка степени тромболизиса показывает, что лучшие результаты (просвет вены практически свободен — выявляли мелкие группы или свободно лежащие эритроциты, без фибрина или с мелкими включениями фибрина) получены при использовании липосомальной капсулированной формы стрептокиназы по сравнению с нативной (p<0,05).

Слабое или умеренное окрашивание цитоплазмы эндотелиальных клеток с антителами к ФВ в венах крыс, отсутствие выраженных микроскопических изменений интимы вен при применении капсулированных форм стрептокиназы в отличие от нативной формы свидетельствуют о возможном протекторном влиянии на эндотелий используемых наноконтейнеров.

Конфликт интересов: коллектив авторов заявляет об отсутствии конфликта интересов в определении структуры исследования, при сборе, анализе и интерпретации данных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Э., И.Э., Г.К.

Сбор и обработка материала — Н.Н., Е.И., И.Л.

Статистический анализ — Г.В.

Написание текста — Т.Э., Г.К.

Редактирование — И.А.