В настоящее время диагностика легочной патологии в существенной мере опирается на визуализацию лучевыми методами, к которым прежде всего относятся рентгенография и компьютерная томография. Но ни один рентгенологический симптом нельзя назвать абсолютно специфичным для того или иного заболевания.

Гистопатологическая оценка ткани с установкой мультидисциплинарных корреляций [1] остается «золотым стандартом» для постановки точного диагноза многих заболеваний легких, включая солитарные образования, рак и диффузные заболевания легких (ДЗЛ). Для морфологического диагноза необходима биопсия пораженных участков паренхимы при проведении бронхоскопии либо хирургическим путем. Выполнение биопсий при ДЗЛ или периферических образованиях в рамках эндоскопического обследования возможно только вслепую, трансбронхиально, что сопряжено с риском развития пневмоторакса (1—12%) [2—5] и выраженного кровотечения (2—9%) [3, 6, 7]. Трансторакальная биопсия предпочтительна для периферических поражений: чрескожно, посредством миниторакотомии или видеоассистированной торакоскопии (ВАТС) [8]. Хирургическая биопсия обусловливает необходимость общего обезболивания, более длительного пребывания в стационаре и сопровождается различными рисками [9], поскольку обычно у группы пациентов, нуждающихся в подобной процедуре, дыхательная система скомпрометирована. Известно, что извлеченные образцы ткани подвержены определенным морфологическим изменениям в результате обезвоживания и химической фиксации, а процесс забора биопсии невозможен без травмы тканевых структур, а это может затруднять дальнейший контроль диспластических изменений данной зоны. Микроскопическое исследование клеток бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) предоставляет дополнительную информацию, однако редко является решающим фактором в постановке диагноза [10, 11].

Белый свет при видеобронхоскопии обычно используется для быстрой макроскопической оценки трахеи, крупных и средних бронхов, но имеет низкую чувствительность для диагностики мелких поверхностных аномалий слизистой оболочки и областей внутриэпителиальной неоплазии [12].

Это привело к развитию таких методов, как аутофлюоресцентная бронхоскопия (AFB) [13—15], осмотр в узком спектре (NBI) [16, 17], бронхоскопия с большим увеличением [18] и оптическая спектроскопия [19], позволяющих лучше распознать изменения тканевых структур. Однако всего этого набора недостаточно, чтобы дифференцировать неоплазию от воспаления или аномалии, т. е. устранить потребность в биопсии ткани, и эти методы не способны дать информацию о состоянии дистальных дыхательных путей диаметром менее 3 мм или обеспечить дополнительную диагностическую информацию во время обследования пациентов с ДЗЛ.

Эндобронхиальный ультразвук (EBUS) становится все чаще используемым инструментом для визуализации вне поверхности слизистой оболочки. Высокочастотные (20 МГц) радиальные ультразвуковые датчики имеют разрешение меньше 1 мм и позволяют различить определенные гистологические особенности стенки бронха [20] и периферических поражений [21, 22], но даже при таком разрешении биопсии все еще необходимы для постановки точного диагноза.

Поэтому необходим поиск технологий визуализации с еще лучшим разрешением и возможностью использовать дополнительное контрастирование с целью обеспечения гистопатологического качества изображения в реальном времени в зоне интереса, или так называемой оптической биопсии, как сейчас принято говорить за рубежом.

Существует 3 основных метода расширенной визуализации, основанных на применении микроскопических технологий и минизондов.

Оптическая когерентная томография (OКT). Метод визуализации, основанный на применении зонда, который используется сразу в нескольких клинических нишах, включая гастроэнтерологию [23], офтальмологию [24], дерматологию [25] и сосудистую медицину [26, 27]. Метод аналогичен ультрасонографии, с той лишь разницей, что используются не акустические волны, а оптическое излучение ближнего инфракрасного диапазона (около 1 мкм), и позволяет оценить величину и глубину светового сигнала, отраженного от различных по оптическим свойствам тканей [28].

Методом ОКТ определяют эхозадержку отраженной световой волны с измерением интенсивности и глубины сигнала. При фокусировании на ткани-мишени светового луча происходят его рассеивание и частичное отражение от внутренних микроструктур на различных глубинах исследуемых тканей. Преимуществом данного метода является отсутствие необходимости прямого контакта с тканью, что устраняет вероятность потенциального физического искажения. Данная технология обеспечивает пенетрацию излучения только на 2—3 мм, однако этого достаточно для диагностики бронхогенной карциномы на самой ранней стадии. Латеральное и аксиальное разрешение при ОКТ достигает 5 мкм, что в 10—20 раз меньше, чем при использовании высокочастотного ультразвука [21], хотя ближе к истине величина 15 мкм, которой достаточно для того, чтобы применение ОКТ позволяло получать изображение на уровне отдельных ядер [29].

Это относительно недорогая и компактная технология. Результатом совместного труда LightLab Imaging (Бостон) и Pentax (Токио) стало производство минизонда диаметром 1,5 мм с радиальным сканированием, который можно ввести через инструментальный канал бронхоскопа [29]; Niris imaging system (Кливленд) создала минизонд с большим разрешением, но и с большим диаметром — 2,7 мм [30].

В ex vivo исследованиях с ОКТ доказана послойная структура бронхиального дерева, с разграничением слизистой оболочки, базальной мембраны и подлежащих надхрящницы и хряща. Особенно хорошо различимы граница между эпителием и хрящом, а также слизистые железы и слой гладкой мускулатуры в пределах подслизистой основы [31]. Удалось визуализировать и структуру альвеол, прилежащих к периферическим дыхательным путям [32]. При in vivo ОКТ с применением вышеупомянутого зонда R. Michel и соавт. [30] отметили, что эти послойные границы ткани разрушаются эндобронхиальными опухолями, что подтверждено и во время флюоресцентного бронхоскопического исследования S. Lam и соавт. [29].

Нарушение структуры и целостности базальной мембраны позволяет дифференцировать инвазивную неоплазию, карциному in situ, дисплазию и метаплазию. Однако разрешение не позволяет определить степень дисплазии.

Таким образом, появление ОКТ дает возможность ранней эндоскопической диагностики микроинвазивных патологических процессов бронхиального дерева и с учетом глубины исследования обладает возможностью визуализировать альвеолярные структуры, что может иметь определенный потенциал для обследования пациентов с ДЗЛ.

Конфокальная флюоресцентная лазерная эндомикроскопия. Миниатюризация конфокального лазерного сканирующего микроскопа теперь позволяет in situ визуализировать очень тонкий поверхностный пласт ткани. Для конфокального отображения in vivo желудочно-кишечного тракта сканирующие зеркала и миниатюрная объективная линза могут быть встроены в эндоскоп [33]; эта техника известна как дистальное сканирование. Альтернативой является размещение зеркал и линзы во внешней коробке с возможностью направления на пациента конфокального лазерного излучения посредством использования тысячи оптических волокон [34]. Эта конфигурация известна как проксимальное сканирование или волоконная конфокальная флюоресцентная микроскопия [35]. Оптические волокна помещены в узкую оболочку, что позволяет полученный в результате зонд вводить в инструментальный канал стандартного эндоскопа.

Основанный на использовании минизонда метод конфокальной лазерной эндомикроскопии (КЛЭМ) был адаптирован специально для дополнения методики бронхоскопии в не имеющей в настоящее время аналогов коммерческой системе Cellvizio-Lung (Mauna Kea Technologies, Франция). Минизонд диаметром 1,4 мм излучает синий свет лазера длиной волны 488 нм, возбуждающий естественную флюоресценцию в тканях легкого, и все структуры, флюоресцирующие в пределах между 500 и 650 нм, фиксируются компьютером с частотой 12 кадров в секунду.

Это обеспечивает почти гистологическое качество изображения, но только на глубине ткани приблизительно 50 мкм и с боковым разрешением 3,5 мкм. Поле зрения составляет лишь 600×500 мкм, однако, если минизонд можно медленно продвигать по площади зоны интереса, то программное обеспечение позволяет «сшить» смежные изображения вместе, чтобы создать более информативную картину исследованного участка ткани [36].

В периферической «оптической биопсии» исследование производится вслепую вне изображения на видеобронхоскопе до получения на мониторе эндомикроскопической системы относительно фиксированного альвеолярного изображения. Поэтому потенциал использования инструмента для мозаичного «сшивания» участков осмотренной ткани в большей мере применим для центральных отделов трахеобронхиального дерева, однако это требует очень осторожных и кропотливых манипуляций минизондом в условиях кардиореспираторных толчков и движений, производимых пациентом, а также обеспечения максимально перпендикулярной позиции с исследуемой тканью.

КЛЭМ изображение, получаемое с большинства эпителиальных поверхностей тела, обусловливает необходимость поверхностного или внутривенного введения внешнего флюоресцентного контрастного вещества, такого как флюоресцеин или акрифлавин. Однако эластин, в изобилии содержащийся в базальной мембране бронхиального дерева, а также в структурах соединительнотканного компонента альвеолярных стенок, выступает в роли эндогенного флюорофора.

Анализ кривой спектра эмиссии продемонстрировал, что эти структуры формируют изображение при КЛЭМ без использования дополнительного внешнего контраста во время бронхоскопии [35]. L. Thiberville и соавт. [35] описали 5 различимых структурных решеток волокон соединительной ткани нормальной базальной мембраны в различных отделах бронхиального дерева, с мелкими устьями ниже уровня долевого ветвления, которые представляют собой бронхиальные железы. При исследовании ракового или предракового эпителия эти структуры становятся дезорганизованными, и интенсивность сигнала флюоресценции уменьшается.

Считается, что доброкачественные заболевания также изменяют визуализацию базальной мембраны при КЛЭМ [37, 38]; например, при сканировании карины пациента с саркоидозом можно увидеть изображение со структурами, подобными гранулематозным [35]. Для получения изображения дыхательного эпителия, лежащего над базальной мембраной, необходимо использовать контраст, причем считается, что крезиловый фиолетовый с pH, близким к физиологическому, нанесенный поверхностно [39], является более эффективным, чем внутривенно введенный флюоресцеин [40].

Недавно разработан прототип конфокального эндомикроскопа с возможностью периферического сканирования [41]. Его диаметр составляет 6,2 мм, отсутствует возможность осмотра в белом свете и методика обусловливает необходимость ригидной бронхоскопии под общей анестезией. Однако с его помощью можно визуализировать только патологические изменения слизистой оболочки крупных бронхов, внутривенно используя флюоресцеин. Главное преимущество таких устройств перед КЛЭМ состоит в том, что периферическая оптика дает возможность регулировать Z-глубину исследования от 0 до 200 мкм, позволяя получать изображение, начиная с отдельных реснитчатых эпителиальных клеток и далее продвигаясь вниз к подслизистой гладкой мускулатуре и микросудам.

Самым тонким доступным в настоящее время бронхоскопом, содержащим рабочий канал, является Pentax FB-8 V с диаметром 2,7 мм, при этом возможно использовать минизонд для КЛЭМ с целью получения микроизображения альвеолярных мешочков [42]. В то же время точность достижения минизондом зоны интереса аналогична таковой при проведении щипцов во время периферической биопсии, КЛЭМ дистальных дыхательных путей не сопровождается риском развития пневмоторакса [42], лишь иногда возникают неинтенсивные кровотечения [43] или отмечается болезненность в грудной клетке при приближении наконечника зонда к плевре [42, 43].

КЛЭМ позволяет различить микроанатомию альвеолярных мешочков, альвеолярных ходов и микрососудов с циклическими изменениями в размере и форме структуры во время дыхательного цикла. Существует мнение, что интенсивность аутофлюоресценции увеличивается с возрастом [44]. Среди здоровых добровольцев макрофаги при КЛЭМ визуализируются только у курильщиков [45], причиной чего является поглощение этими клетками табачных смол [46]. У большинства активных курильщиков, которые подвергаются бронхоскопии, эти яркие макрофаги являются дополнительным эндогенным флюорофором.

В наиболее ранних работах установлено, что КЛЭМ-изображения у пациентов с тяжелой эмфиземой отличаются от нормы меньшим количеством и большим расстоянием между эластическими волокнами в альвеолярных стенках и ходах [43, 47]; при тяжелой хронической обструктивной болезни легких в пределах альвеол эластин оказывается почти полностью исчерпанным [48]. Будущие работы, посвященные КЛЭМ, направлены на установление морфологических различий в эластическом каркасе в норме и при различной патологии [49]. Поверхностно нанесенные контрастные вещества необходимы для того, чтобы в последующем охарактеризовать эпителий [39, 40] и его изменения с прединвазивным поражением. Внутривенные контрастные вещества, по мнению ряда авторов, могли бы помочь установить характерные изменения в микроциркуляторном русле при отдельных заболеваниях легких [45], подобно тому, как уже установлено в желудочно-кишечном тракте [50].

Внутривенно введенный флюоресцеин мог бы помочь прояснить некоторые аспекты при периферических поражениях [40] или же стоит использовать другой подход в КЛЭМ с использованием длины волны 660 нм и введением метиленового синего в ацинус через широкий рабочий канал [51]. Тогда при более низкой частоте метиленовый синий будет флюоресцировать. В будущем комбинация длин волн при КЛЭМ может использоваться для возбуждения одновременной аутофлюоресценции от различных эндогенных источников, что позволит получить дополнительную информацию [52].

Другие недавние важные достижения в области биофотоники включают двухфотонную лазерно-индуцированную флюоресценцию и генерацию второй гармоники в ткани [53]. Эти методы используют короткий пульс инфракрасного света, чтобы вызвать сигнал, который как увеличивает глубину проникновения, так и повышает диагностическую эффективность за счет высокоэнергетического возбуждения, без использования потенциально опасного ультрафиолетового света. До сих пор такая техника применялась только для исследования кожи, однако большое количество исследовательских групп работают над внедрением метода в эндоскопическую практику [54].

Эндоцитоскопия. Эндоцитоскоп — система, позволяющая в реальном режиме времени in vivo получить изображение тканей на клеточном уровне в условиях белого света. Методика базируется на принципе контактной микроскопии, когда изображение фиксируется только при непосредственном контакте с тканями, и была впервые применена для микрогистероскопии [55]. С тех пор она в большинстве своем использовалась для исследований в диагностике рака желудочно-кишечного тракта [56—59], а также мочевых путей [59]. Детализированная визуализация ядер позволяет четко дифференцировать нормальные клетки от злокачественных, провести четкие границы между атипическим и нормальным эпителием, выявить различия в клеточном составе, оценить размеры и формы ядер [60]. Техника представляется наиболее эффективной при исследовании толстой кишки и пищевода [61].

Применение 0,5—1% раствора метиленового синего в зоне интереса позволяет сделать более четкой визуализацию клеточных структур вплоть до уровня ядер, обеспечивая практически цитологические качество изображений. Это исключает потребность в биопсии [61], а также позволяет избежать тех изменений, которым подвергаются образцы ткани ввиду их деформации во время биопсии и химической обработки при подготовке к гистологическому исследованию. Однако слизь и кровь могут ограничить применение контрастного вещества и препятствовать получению качественных изображений. Частично с этой проблемой можно справиться за счет использования муколитических средств [62].

Позже, благодаря созданию бронхоскопа XEC-300-U/F («Olympus», Токио, Япония), эндоцитоскопия стала возможной и для дыхательных путей [63], метод доступен в качестве интегрированной системы с обычным изображением и подключением функции эндоцитоскопии. Кроме того, существует возможность использования ультратонкого зонда диаметром 3,2 мм, однако при этом необходим бронхоскоп с более широким рабочим каналом и, соответственно, имеющий больший наружный диаметр [64]. Обе системы обладают пространственным разрешением в 4,2 мкм и увеличением ×570, с полями зрения 400×400 мкм и 300×300 мкм соответственно.

В отличие от КЛЭМ, эндоцитоскопическое изображение представлено в цвете, но недостаточная глубина исследования (аналогично КЛЭМ; максимум до 50 мкм) позволяет получить только двухмерное изображение поверхности ткани, тогда как КЛЭМ строит ограниченное трехмерное цифровое изображение зоны исследования, т. е. одновременно отображает стенки множества альвеолярных мешочков, ответвляющихся от альвеолярных ходов. К тому же меньший размер минизонда для КЛЭМ позволяет достичь самых дистальных отделов дыхательных путей. Существующая система КЛЭМ с длиной волны 488 нм позволяет увидеть лишь волокна эластина, но при помощи контрастных веществ можно получить визуальную информацию и на клеточном уровне, чтобы дополнить цитологический и гистологический анализ, возможный благодаря эндоцитоскопу.

Действительно, в ранних работах авторы сообщали, что полученные in vivo эндоцитоскопические изображения опухолей бронхов, орошенных метиленовым синим, очень похожи на гистологические, с увеличением клеточной плотности, количества полиморфных клеток и ядерно-цитоплазматического соотношения по сравнению с изображениями нормальной слизистой оболочки [64, 65].

В настоящее время описанные в данном обзоре перспективные методы визуализации используются в основном лишь как дополнительные инструменты исследования, но их применение становится все более широко доступным (пока только за рубежом), так как дает реальную возможность существенно повысить качество прижизненной диагностики изменений в любом полом органе. Это особенно перспективно в области респираторной медицины, поскольку существующие диагностические методы, такие как трансбронхиальная и трансторакальная биопсия, сопряжены с определенным риском для пациентов с нарушенной дыхательной функцией, и при этом не всегда позволяют получить необходимый материал.

Финансовые затраты на методы этой новой области «оптической биопсии» и дополнительное время, необходимое для их применения в процессе повседневного исследования, могут быть оправданы, если удастся доказать, что эффект их использования оказывает существенное влияние на процесс диагностики и последующего лечения. В будущем, после проведения обширных клинических исследований, которые помогут установить чувствительность и специфичность метода в сравнении с гистопатологическим, «оптическая биопсия» может стать дополнением к аутофлюоресцентной бронхоскопии, повышая ее специфичность и обеспечивая получение более качественного материала при внутрипросветной и трансбронхиальной биопсии. Определенную роль могли бы сыграть эти методы и в контроле диспластических изменений дыхательных путей, вероятно, даже с возможностью способствовать спонтанному регрессу части таких нарушений за счет воздействия лазерного излучения (подобно методике фотодинамической терапии). Ввиду того что возможность дальнейшего мониторинга зоны непосредственного забора биопсийного материала весьма ограничена рубцовыми изменениями, неизбежно возникающими в результате нарушения целостности ткани, очень ценным представляется потенциал новых методов в достижении полного удаления патологического очага или опять же в возможности вызвать спонтанный регресс неопластического процесса [44].

Нередко пациенты подвергаются необоснованному риску в процессе выполнения повторных биопсий при попытках гистологически верифицировать изменения, которые в рамках развития неопластического процесса никогда не приобретут признаки злокачественности. «Оптическая биопсия» может стать ценным инструментом при диагностике ДЗЛ, когда пациентов с высоким риском развития различных осложнений можно будет оградить от выполнения инвазивной биопсии, а вместо этого использовать многократные альвеоскопии, контролируя динамику патологического процесса на фоне лечения или без него [66, 67]. Эти методы могут также сократить сроки постановки диагноза, обеспечив более раннее начало лечения и состояние психологического комфорта для пациента, которому не придется длительно ожидать вердикта диагностического поиска.