Введение

В последние годы во всем мире отмечается неуклонный рост заболеваемости воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) [1]: число больных за период с 1990 по 2017 г. увеличилось с 3,7 до более чем 6,8 млн человек [2]. В России заболеваемость язвенным колитом (ЯК) составляет 2—3 случая на 100 тыс. населения [3]. Высокая заболеваемость ВЗК в экономически развитых странах объясняется совокупностью факторов: улучшением социально-экономических и санитарных условий окружающей среды в современном обществе, изменениями в рационе питания, доступностью проведения эндоскопического исследования, уровнем осведомленности как пациентов, так и врачей о данной нозологии. Современный образ жизни оказывает существенное влияние на микробный пейзаж кишечника [4]. Социальная значимость этих заболеваний обусловлена необходимостью проведения постоянной дорогостоящей длительной, часто пожизненной, терапии, высоким риском инвалидизации, трудоспособным возрастом больных, регулярным физикальным, лабораторным и инструментальным обследованием, потребностью в госпитализации, повышением качества и увеличением продолжительности жизни, а также предотвращением прогрессии патологического процесса и развития осложнений [5].

ЯК является одной из двух форм ВЗК. В качестве основной теории патогенеза ЯК рассматриваются нарушение иммунорегуляции и активация иммунного ответа под воздействием определенных факторов внешней среды по отношению к антигенам собственной кишечной микрофлоры у генетически предрасположенных к этому лиц [6]. В результате этого в слизистой оболочке толстой кишки больных формируется воспалительно-деструктивный процесс, реализуемый посредством нейтрофилов [7]. Одной из типовых защитных стратегий нейтрофила является процесс формирования ими внеклеточных ловушек — нетоз (от англ. neutrophil extracellular traps, NET). Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) представляют собой сеть деконденсированного хроматина, высвобождающуюся из нейтрофильного лейкоцита в ответ на контакт с антигеном, который этот лейкоцит не в состоянии уничтожить при помощи фагоцитоза, дегрануляции и генерации активных форм кислорода [8]. На поверхности сети фиксировано содержимое гранул нейтрофилов — ферменты миелопероксидаза, нейтрофильная эластаза. Нетоз, с одной стороны, является защитной реакцией, с другой — дисрегуляция подобных механизмов играет существенную роль в патогенезе ряда заболеваний, сопряженных с развитием воспаления, наличием аутоиммунных реакций, нарушений системы гемостаза, и уже описана при ревматоидном артрите, туберкулезе, сепсисе, новой коронавирусной инфекции. Существенная роль нетоза показана рядом авторов и при ВЗК [8—12].

Однако оценка нетоза как лабораторного маркера в настоящее время пока не нашла в клинической практике широкого применения, а скорее, представлена «экспериментальной методикой». В настоящее время для исследования нетоза используются методы проточной цитофлуориметрии, иммуноферментного анализа, световой и люминесцентной (флюоресцентной) микроскопии. В частности, совместное количественное определение в сыворотке крови цитруллинированного гистона Н3, миелопероксидазы, нейтрофильной эластазы с помощью иммуноферментного метода исследования позволяет оценить фактически состоявшийся нетоз, а исследование нетозобразующей способности нейтрофилов методом флюоресцентной микроскопии после воздействия стимулятора in vitro оценивает потенциальную способность нейтрофилов формировать внеклеточные сети ДНК. Кроме того, исследователями используются иммуногистохимические методы выявления нейтрофильных ловушек в биоптатах тканей. Таким образом, каждый из этих методов имеет свои особенности и ограничения при применении. Нами осуществлена попытка сравнить нетозобразующую активность нейтрофилов, выделенных из крови больного ЯК, с показателями индуцированного нетоза здоровых добровольцев с использованием метода люминесцентной микроскопии.

Цель исследования — демонстрация результатов определения нетозобразующей активности нейтрофильных лейкоцитов пациента с ЯК.

Материал и методы

Исследование нетозобразующей способности нейтрофилов пациента с ЯК выполнено в рамках одного клинического случая. Результат оценивали в сравнении со значениями нетозобразующей активности нейтрофилов здоровых добровольцев (n=12), полученных с использованием нашей оригинальной методики. По результатам исследований рассчитаны медиана (Me), 25-й (LQ) и 75-й (HQ) процентили. Как от обследуемого, так и от здоровых добровольцев получено информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России.

Изучение НВЛ проводили в центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России. Для исследования использовали образцы гепаринизированной венозной крови, исследуя ее не позднее, чем через 30 мин с момента взятия образца. Для взятия крови использовали стандартные вакуумные пробирки и принадлежности к ним. Взятие крови проводили натощак, при условии предшествующего 10-часового голодания, отсутствия чрезмерных физических нагрузок накануне исследования. Лейкоциты выделяли из образцов цельной крови после центрифугирования в двойном градиенте плотности фикола-верографина (плотность — 1,077 и 1,105 соответственно). Для анализа НВЛ использовали оригинальную методику, разработанную членами авторского коллектива ЦНИЛ «Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови» (Решение о выдаче патента на изобретение от 24.02.22; «Федеральный институт промышленной собственности»; Заявка №2021129097, дата приоритета от 06.10.21). Исследовали интактные нейтрофильные лейкоциты, которые инкубировали в течение 30 мин без пробиотика и подвергли инкубации с пробиотиком в течение 30 мин при 37 °C. Использовали препарат, содержащий смесь Lactobacillus (L.) reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. После инкубации нейтрофилы наносили на обезжиренное предметное стекло и инкубировали с моноклональными антителами к CD15, меченными FITC («Dako-Agilent», США). Препарат окрашивали ДНК-интеркалирующим красителем йодидом пропидия. Готовили препарат «раздавленная капля». Результат оценивали при помощи люминесцентного микроскопа Микмед-2 вар. 11 («ЛОМО», Россия), используя комбинацию светофильтров, соответствующую спектрам поглощения/испускания флюоресцентных красителей. Подсчитывали процентное содержание в препарате неактивных нейтрофильных гранулоцитов (клетки с прокрашенной цитолеммой, но без прокрашенного ядра), активированных нейтрофилов, не сформировавших НВЛ (клетки с прокрашенными цитолеммой и ядром) (рис. 1, а, б), облаковидных НВЛ (рис. 1, в, г) (неструктурированная ДНК располагалась вокруг нейтрофила) и нитевидных НВЛ (НВЛ с сетчатой структурой, превышающая размер нейтрофила в несколько раз, рис. 2).

Рис. 1. Неактивный (а) и активированный (б) нейтрофил. Облаковидные нейтрофильные внеклеточные ловушки здорового волонтера (в) и нейтрофильные внеклеточные ловушки пациента с язвенным колитом (г).

В облаковидных нейтрофильных внеклеточных ловушках визуализируются захваченные палочковидные бактерии пробиотика. Иммуноокрашивание маркера человеческих нейтрофилов CD15 (зеленый). Интеркалирующая окраска йодидом пропидия (красный), увеличение ×630.

Фото авторов.

Рис. 2. Нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки здорового волонтера (а) и пациента с язвенным колитом (б).

Нейтрофильные внеклеточные ловушки здорового волонтера (а) значительно уступают в размерах нейтрофильным внеклеточным ловушкам пациента с язвенным колитом (б). Интеркалирующая окраска йодидом пропидия (красный), увеличение ×630. Фото авторов.

Результаты

Нейтрофилы больного ЯК (Пациент А., 1993 года рождения) продемонстрировали более выраженную способность к нетозу как в интактном состоянии (без стимуляции пробиотиком), так и после стимуляции (рис. 3). В частности, нейтрофилы здоровых добровольцев после инкубации без стимулятора формировали 2% облаковидных и 2% нитевидных НВЛ, а нейтрофилы пациента с ЯК — 10 и 15% соответственно. После инкубации с пробиотиком у здоровых добровольцев регистрировали 5% облаковидных и 9% нитевидных НВЛ, а нейтрофилы пациента с ЯК сформировали существенно большее количество НВЛ — 16% облаковидных и 29% нитевидных (см. рис. 3). Интересным является тот факт, что НВЛ, образуемые нейтрофилами пациента с ЯК, после стимуляции пробиотиком отличались значительными размерами сетей, превышая размер нейтрофила в 10—18 раз, в то время как в контроле размер НВЛ был лишь в 4—8 раз больше исходного размера нейтрофила (см. рис. 2). НВЛ больного ЯК демонстрировали более выраженную способность захватывать палочковидные бактерии — 21 захваченная НВЛ бактерия пациента с ЯК при контрольных показателях здоровых добровольцев Me 7,5; LQ 4,75; HQ 10,5 (см. рис. 3).

Рис. 3. Соотношение разных групп клеток и морфологических эквивалентов нетоза (%) и количество захваченных нейтрофильными внеклеточными ловушками бактерий (у.е.), визуализируемых при люминесцентной микроскопии препарата изолированных нейтрофилов крови здоровых добровольцев (столбчатая диаграмма с доверительными интервалами Me (LQ; HQ)) и пациента с язвенным колитом (синие и красные кольца) после 30 мин инкубации без пробиотика и 30 мин инкубации с пробиотиком.

У пациента с язвенным колитом в исследуемых образцах отмечается повышенное содержание нитевидных и облаковидных нейтрофильных внеклеточных ловушек после инкубации как без пробиотика, так и с пробиотиком, соответственно снижается процентное содержание неактивных нейтрофилов.

Клинический случай

Пациент А., 1993 года рождения. Обратился с жалобами на примесь крови и слизи в каловых массах, стул до 5 раз в сутки, вздутие живота и ноющую боль в гипогастральной области постоянного характера. Из анамнеза заболевания: заболел 5 лет назад, когда впервые обратил внимание на эпизодически появляющуюся примесь крови в каловых массах. За медицинской помощью обратился лишь 1 год спустя, когда субъективно стал отмечать признаки прогрессирования заболевания. По данным обследования, диагностирована среднетяжелая атака ЯК в форме проктита. На фоне терапии препаратами месалазина из группы 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) и ректальными формами глюкокортикостероидов отмечена клиническая и эндоскопическая ремиссия заболевания. Далее с поддерживающей целью принимал препараты 5-АСК (2 г/сут). Ухудшение самочувствия за полгода до обращения связал с регулярными погрешностями в питании. Самостоятельно увеличена доза месалазина, однако положительного эффекта это не принесло. За 1 нед до обращения стала повышаться температура тела до 37,5 °C. Пациент обратился за медицинской помощью, при обследовании в общем анализе крови Hb 105 г/л, эр. 3,5×10¹²/л, л. 12,2×10⁹ /л, СОЭ 38 мм/ч, С-реактивный белок 17,3 мг/л, фекальный кальпротектин 534 мкг/г. По данным колоноскопии: слизистая оболочка прямой кишки от зубчатой линии на протяжении 8—10 см по всем стенкам тусклая, шероховатая с язвенными дефектами с фибрином и гноем (рис. 4). На расстоянии 8—10 см от ануса до купола слепой кишки включительно слизистая оболочка розовая, блестящая, сосудистый рисунок виден четко. Сигмовидная кишка значительно удлинена. Морфологически — отечность, инфильтрация лимфоцитами подслизистого слоя и собственной пластинки стенки кишки, локальный эндоваскулит, сглаживание структуры крипт.

Рис. 4. Ампула прямой кишки. Слизистая оболочка тусклая, шероховатая, с язвенными дефектами, с фибрином и гноем.

Фото авторов.

Диагностирован ЯК, среднетяжелая атака, проктит, умеренная активность. Железодефицитная анемия легкой степени тяжести. Лечение проведено в соответствии с «Клиническими рекомендациями по диагностике и лечению язвенного колита», 2017 г. [9] с включением ректальных форм 5-АСК и глюкокортикостероидов, а также пероральных форм месалазина с положительным клиническим и эндоскопическим эффектом. В настоящее время пациент продолжает прием аминосалицилатов в поддерживающей дозе. Проводится регулярный контроль фекального кальпротектина и общеклинических исследований.

Обсуждение

При исследовании препарата изолированных нейтрофилов крови больного ЯК нами обнаружена способность нейтрофилов формировать ловушку. Кроме того, мы оценили интенсивность процесса нетоза у больного ЯК по сравнению со здоровыми добровольцами. Формирование нейтрофильных ловушек у больного ЯК происходит значительно интенсивнее как по количеству сформировавшихся сетей, так и по их размерам. Адгезивная способность НВЛ у пациента также выше, чем в контроле, что проявлялось большим количеством захваченных палочковидных бактерий пробиотика. Можно предположить, что у пациента с ЯК наличие хронического воспалительного процесса изменяет реактивность нейтрофила, он становится более чувствительным к воздействию стимуляторов нетоза, что можно объяснить присутствием в крови провоспалительных цитокинов, простагландинов, лейкотриенов, белков теплового шока, белков острой фазы воспаления. Перечисленные биологически активные вещества могут изменить состав и плотность рецепторов на поверхности мембраны нейтрофилов, а также запустить в клетках рецептор-опосредованные сигналы нетоза, что в подобных клинических ситуациях и объясняет их повышенную реактивность. Повышенное содержание в кале фекального кальпротектина, источником которого являются нейтрофилы, позволяет сделать предположение, что у пациентов с ЯК НВЛ могут формироваться в стенке кишки. Это подтверждается в работах ряда исследователей указаниями на косвенные маркеры нетоза — повышение активности PAD4 (пептидил-аргинин деиминазы 4) [10], изменения протеомного профиля клеток, свидетельствующего об инициированном нетозе [11]. В свою очередь избыточное содержание НВЛ в слизистой оболочке кишки может вызвать ряд негативных последствий (рис. 5), например повреждать клетки эпителия кишки, способствовать апоптозу клеток эпителия, что в конечном итоге может приводить к избыточной бактериальной транслокации в стенку кишки и усилению секреции медиаторов воспаления резидентными иммунными клетками [12]. НВЛ могут разрушать соединительно-тканный матрикс и терапевтические антитела. Однако малоинвазивных способов определения НВЛ в слизистой оболочке кишки в настоящее время не существует. Учитывая указанные обстоятельства, оценку нетоза в препаратах изолированных нейтрофилов крови больного ЯК можно рассматривать как возможный дополнительный неспецифический маркер для мониторинга течения воспалительной реакции.

Рис. 5. Возможное повреждающее действие нейтрофильных внеклеточных ловушек, избыточно формирующихся в кишечной стенке при воспалительных заболеваниях кишечника.

Полученные данные свидетельствуют о том, что нейтрофильные внеклеточные ловушки способны повреждать эпителиальный барьер кишечника, способствуя нарушению межклеточных соединений (1) и апоптозу эпителиальных клеток (2), что приводит к повышению проницаемости кишечника и транслокации бактерий в кишечную стенку. Снижение барьерной функции и транслокация микроорганизмов усиливают эмиграцию нейтрофилов и моноцитов (3). Нейтрофильные внеклеточные ловушки повреждают соединительную ткань путем деградации компонентов внеклеточного матрикса (4) и способствуют усилению воспаления, опосредуя увеличение высвобождения медиаторов воспаления иммунными клетками (5). Можно предположить и другие эффекты нейтрофильных внеклеточных ловушек, которые нуждаются в дальнейшем изучении, такие как разрушение терапевтических моноклональных антител (6), секреторных IgA протеолитическими ферментами, фиксированными в ловушке, а также возможный дефект клиренса нейтрофильных внеклеточных ловушек из-за снижения активности ДНКаз, наблюдаемых у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.

Рисунок авторов.

Заключение

Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек при заболеваниях кишечника является относительно новой и малоизученной областью. На наш взгляд, изучение специфических для воспалительных заболеваний кишечника механизмов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек позволит прогнозировать и мониторировать ответ на проводимую терапию наряду с такими неинвазивными маркерами, как фекальный кальпротектин и С-реактивный белок, рекомендованными Комитетом по выбору терапевтических мишеней при воспалительных заболеваниях кишечника STRIDE II [13]. Можно также оценить «глубину ремиссии» язвенного колита, что особенно актуально в аспекте профилактики развития колоректального рака. Кроме того, изучение нетоза поможет в разработке новых методов лечения воспалительных заболеваний кишечника, направленных на снижение активности нейтрофилов, замедление высвобождения и ускорение клиренса нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.