Гетерогенность иммуногистохимического статуса микросателлитной нестабильности при раке желудка: клинико-патологические ассоциации и прогностическое значение

Рак желудка (РЖ) продолжает оставаться серьезной проблемой мирового здравоохранения, занимая 5-е место среди онкологических заболеваний по смертности и частоте встречаемости и характеризуясь агрессивным течением и частой диагностикой на поздних стадиях [1]. Для части пациентов перспективные возможности представляет применение иммунотерапевтических препаратов, ввиду чего оценка предикторов ответа опухоли является необходимым этапом обследования. Один из самых широко применяемых маркеров — микросателлитная нестабильность (MSI), наличие которой настоятельно рекомендуется оценивать перед началом лечения первой линии не только при прогрессирующем РЖ, но и при локализованных операбельных опухолях желудка в тех случаях, когда планируется назначение неоадъювантной терапии [1, 2]. Подключение иммунотерапии к стандартным схемам лечения может значительно улучшить выживаемость пациентов [2]. MSI не только обладает предиктивным потенциалом в отношении иммунотерапии, но и является надежным маркером более благоприятного прогноза при РЖ [1]. Метод выбора для анализа MSI — иммуногистохимическое (ИГХ) исследование маркеров системы репарации неспаренных оснований (mismatch repair system; MMR) [3]. С широким внедрением в клиническую практику маркеров MMR связано появление феномена их субклонального или гетерогенного внутриопухолевого ИГХ-окрашивания (далее — гетерогенность MMR), обозначающее наличие очаговой потери окрашивания в части опухолевых клеток на фоне сохранного окрашивания. Согласно данным литературы, существуют пилотные исследования этого явления в колоректальном раке (КРР) и раке эндометрия (РЭ), которые подтверждают лежащие в его основе молекулярно-генетические изменения [4—9]. Вместе с тем гетерогенность MMR крайне мало исследована в РЖ: не только патогенез, но клиническое значение этого явления требует дальнейшего изучения для разработки рекомендаций по его интерпретации. Отсутствие стандартизированного подхода по оценке гетерогенности MMR влечет за собой сложности в определении статуса MSI опухоли, неясность в целесообразности проведения дополнительного генетического тестирования.

Цель настоящего исследования — изучение распространенности гетерогенности MMR в РЖ, поиск корреляций с клинико-морфологическими параметрами и анализ прогностической роли этого явления.

В рамках исследования проанализирован полноразмерный операционный материал (парафиновые блоки) от 310 пациентов с морфологически верифицированным РЖ, не получавших неоадъювантную терапию. Морфологическое подтверждение диагноза осуществлялось в соответствии с Международной классификацией опухолей пищеварительной системы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2019 г. [10].

Каждый образец окрашен с антителами к маркерам MMR: MSH2 (79H11, Leica, RTU), MSH6 (EP49, Leica, RTU), MLH1 (ES05, Leica, RTU), PMS2 (EP51, Leica, RTU). Исследование проведено по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем с соответствующими антителами.

Гистологические препараты изучали при помощи светового микроскопа Leica DM4000B (компонент интерактивной микроскопической системы (441-2010), приобретенной по Программе развития МГУ, ID 9351706), сканированные изображения получены при помощи сканера Pannoramic 3DHistec.

При положительной ядерной реакции во всех опухолевых клетках случаи расценивались как MMR-позитивные (при наличии позитивного внутреннего контроля — положительной реакции в окружающих стромальных клетках, гладкомышечных клетках, нормальных эпителиальных клетках). Опухоли относились к MMR-негативным (дефицитным), если полностью отсутствовало ядерное окрашивание хотя бы одного из маркеров (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2). При очаговой потере окрашивания в части опухолевых клеток на фоне сохранного окрашивания опухоли и стромы случаи были классифицированы как MMR-позитивные с частичной гетерогенностью (MMR-позитивные/гетерогенные) (рис. 1). Наличие в части MMR-негативных случаев гетерогенности окрашивания одного или обоих сохранных маркеров явилось причиной выделения второго гетерогенного фенотипа — MMR-негативных с частичной гетерогенностью (MMR-негативных/гетерогенных) (рис. 1). При отсутствии экспрессии одновременно в опухолевых клетках и окружающих нормальных клетках случаи исключались из анализа.

Рис. 1. Алгоритм оценки MMR-статуса.

Статистический анализ данных выполнялся при помощи программного обеспечения IBM SPSS 26. Сравнение количественных показателей между двумя независимыми группами выполнялось с использованием t-критерия Стьюдента (для нормально распределенных данных) и U-критерия Манна—Уитни (для данных с распределением, отличным от нормального). Сравнение трех и более групп по количественным показателям выполнялось с применением непараметрического критерия Краскела—Уоллиса; для апостериорных попарных сравнений применялся критерий Данна. Сравнение качественных показателей между группами выполнялось с использованием критерия χ² Пирсона и точного критерия Фишера (при ожидаемых частотах менее 5). Оцениваемые параметры: пол, возраст, локализация опухоли по третям желудка, локализация опухоли, макроскопическая форма по R. Bormann, размеры опухоли, гистологический подтип (по последней классификации ВОЗ, 2019 г.), гистологический тип по P. Lauren, степень дифференцировки (ВОЗ, 2010, 2019 г.), наличие эмболов в лимфатических сосудах, наличие эмболов в кровеносных сосудах, глубина инвазии (T), метастазы в регионарных лимфатических узлах (N), отдаленные метастазы (M), клиническая стадия, статус общей выживаемости. В соответствии с Международной классификацией опухолей пищеварительной системы ВОЗ, 2019 г. [10] степень дифференцировки определялась только при тубулярном и папиллярном гистологическом подтипе, поэтому в анализ по данному параметру (по классификации как 2010 г., так и 2019 г.) вошло меньшее количество наблюдений: MMR-позитивный — n=166, MMR-позитивный/гетерогенный — n=32, MMR-негативный — n=17, MMR-негативный/гетерогенный — n=7.

Анализ общей 5-летней выживаемости проводился с использованием метода Каплана—Мейера. Сравнение кривых выживаемости между группами выполнялось с помощью лог-рангового критерия. Для оценки влияния нескольких факторов на общую выживаемость использовалась модель пропорциональных рисков Кокса (многофакторная регрессия Кокса). Результаты представлены в виде отношения рисков (HR) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Статистическая значимость определена при уровне p<0,05.

В исследуемой когорте пациентов MMR-позитивный/гетерогенный статус встречался в 11% (34/310) случаев, что составило 11,9% (34/285) от MMR-позитивного; MMR-негативный/гетерогенный — в 2,3% (7/310), 28% (7/25) от MMR-негативного (табл. 1, рис. 2, 3). Таким образом, на долю MMR-позитивных опухолей пришлось 81% (251/310), MMR-негативных — 5,8% (18/310) (табл. 1).

Таблица 1.Распределение MMR-статуса в исследуемой когорте пациентов

Рис. 2. MMR-позитивный статус с частичной гетерогенностью (MMR-позитивный/гетерогенный).

Очаговая потеря окрашивания антителами к MSH2 (а) и MSH6 (б) в части опухолевых клеток на фоне сохранного окрашивания опухоли и стромы; сохранная экспрессия MLH1 (в) и PMS2 (г) в опухоли и строме.

Иммуногистохимическая реакция, ×20.

Focal loss of staining with antibodies to MSH2 (a) and MSH6 (b) in some tumor cells against the background of preserved staining of the tumor and stroma; preserved MLH1 (c) and PMS2 (d) expression in the tumor and stroma.

Immunohistochemical reaction, ×20.

Рис. 3. MMR-негативный статус с частичной гетерогенностью (MMR-негативный/гетерогенный).

а — сохранное окрашивание опухоли и стромы антителами к MSH2; б — очаговая потеря окрашивания антителами к MSH6 в части опухолевых клеток на фоне сохранного окрашивания опухоли и стромы; полная потеря окрашивания опухоли и стромы антителами к MLH1 (в) и PMS2 (г). Иммуногистохимическая реакция, ×20.

a — preserved staining of the tumor and stroma with antibodies to MSH2; b — focal loss of staining with antibodies to MSH6 in some tumor cells against the background of preserved staining of the tumor and stroma; complete loss of staining of the tumor and stroma with antibodies to MLH1 (c) and PMS2 (d). Immunohistochemical reaction, ×20.

Обнаружены статистически значимые различия по следующим клинико-морфологическим признакам (табл. 2, рис. 4): в MMR-позитивном/гетерогенном по сравнению с MMR-позитивным статусом чаще наблюдалось отсутствие перстневидных клеток (p<0,001) (рис. 4, а), 1—2 макроскопические формы (R. Bormann) (p=0,046) (рис. 4, б), папиллярный и тубулярный гистологические подтипы (ВОЗ, 2019) (p<0,001) (рис. 4, в), кишечный гистологический подтип (P. Lauren) (p<0,001) (рис. 4, г), более высокая степень дифференцировки (1—2 по ВОЗ, 2010, low grade по ВОЗ, 2019) (p<0,001) (рис. 4, д), более ранняя стадия заболевания (IA-IIA) (p=0,024) (рис. 4, е).

Таблица 2. Сравнительный анализ MMR-позитивных/гетерогенных и MMR-позитивных опухолей

Рис. 4. Сравнительный анализ MMR-позитивных/гетерогенных и MMR-позитивных опухолей по параметрам.

а — наличие перстневидных клеток; б — макроскопическая форма (R. Bormann); в — гистологические подтип (ВОЗ, 2019); г — гистологический подтип (P. Lauren); д — степень дифференцировки (ВОЗ, 2019); е — клиническая стадия (χ² Пирсона).

a — presence of signet ring cells, b — macroscopic form (R. Bormann), c — histological subtype (WHO 2019), d — histological subtype (P. Lauren), e — differentiation grade (WHO 2019), f — clinical stage (Pearson’s χ²).

Подгруппы MMR-негативных/гетерогенных и MMR-негативных опухолей статистически не различались по изучаемым параметрам. При сравнении MMR-позитивного/гетерогенного и MMR-негативного/гетерогенного статусов между собой выявлено, что для последнего характерны более старший возраст пациента (p=0,024) и дистальная локализация поражения (p=0,033) (табл. 3, рис. 5).

Таблица 3.Сравнительный анализ MMR-позитивных/гетерогенных и MMR-негативных/гетерогенных опухолей

Рис. 5. Сравнительный анализ MMR-позитивных/гетерогенных и MMR-негативных/гетерогенных опухолей по параметрам.

а — возраст (t-критерий); б — локализация (χ² Пирсона).

a — age (t-test), b — localization (Pearson’s χ²).

При анализе методом Каплана—Мейера MMR-позитивный/гетерогенный статус в отличие от MMR-позитивного имел тенденцию к более благоприятной общей выживаемости (p=0,01; медиана 61 мес против 36 мес) (табл. 4).

Таблица 4. Попарные отношения рисков (hazard ratio) с 95% доверительными интервалами

Учитывая, что доверительный интервал включает значение 1 (HR 1,77; 95%ДИ: 1,00—3,12; p=0,05), полученный результат следует рассматривать как статистически значимый, но находящийся на границе эффекта и требующий подтверждения в дальнейших исследованиях (табл. 4). Результаты анализа не показали значимых различий между MMR-негативными/гетерогенными и MMR-негативными опухолями, а также подгруппами гетерогенных статусов.

В многофакторном анализе общей выживаемости MMR-статус демонстрировал пограничную статистическую значимость (p=0,058). По сравнению с пациентами с MMR-позитивным статусом пациенты с MMR-негативным статусом имели тенденцию к лучшей выживаемости (HR 0,474; 95%ДИ: 0,219—1,026; p=0,058). Аналогичная тенденция наблюдалась для пациентов с MMR-негативным/гетерогенным статусом (HR 0,259; 95% ДИ: 0,063—1,065; p=0,061). Пациенты с MMR-позитивным/гетерогенным статусом не имели значимых отличий от пациентов с MMR-позитивным статусом (HR 0,733; 95% ДИ: 0,413—1,303; p=0,290).

Необходимость определения MMR-статуса опухоли в клинической практике обусловлена тем, что этот параметр предоставляет важнейшие данные о прогнозе и потенциальных терапевтических опциях. Явление, затрудняющее оценку ИГХ-окрашивания маркеров MMR, гетерогенность MMR, — практически неизученный феномен при РЖ как в российском, так и зарубежном медицинском сообществе. В литературе имеются данные немногочисленных исследований, позволяющие предполагать, что гетерогенные участки несут в себе различные молекулярные или эпигенетические нарушения — соматические мутации генов или метилирование промотора MLH1 [3, 11]. Следовательно, маловероятно, что этот факт носит случайный характер или является артефактом, связанным исключительно с методикой окраски гистологических препаратов. Детальная характеристика гетерогенности MMR в РЖ в зависимости от клинико-морфологических параметров и оценка ее прогностического потенциала на репрезентативной выборке пациентов ранее не проводились.

В исследуемой когорте пациентов с РЖ это явление было обнаружено в 41 (13,2%) случае, что согласуется с данными (3—10%) зарубежной литературы [12, 13]. В нашем случае наличие неравномерного окрашивания сохранных маркеров в некоторых MMR-негативных опухолях стало причиной выделения двух отдельных подгрупп гетерогенности — MMR-позитивных/гетерогенных (11%, n=34) и MMR-негативных/гетерогенных опухолей (2,3%, n=7). Данный аспект гетерогенности — сочетание с MMR-негативным фенотипом — ранее был отмечен зарубежными коллегами, однако в опухолях других локализаций (КРР, РЭ и аденоме сальной железы), более того, исследования были нацелены на изучение преимущественно молекулярно-генетических изменений [6] и иммунного ландшафта [7]. Результаты анализа выживаемости Каплана—Мейера не показали клинико-морфологических и прогностических различий MMR-негативной/гетерогенной подгруппы с MMR-негативными опухолями. Вместе с тем в многофакторном регрессионном анализе выявлена тенденция к более благоприятной выживаемости пациентов с MMR-негативными/гетерогенными опухолями по сравнению с MMR-позитивным статусом (HR 0,259; 95%ДИ: 0,063—1,065; p=0,061): тенденция, аналогичная и для MMR-негативных опухолей (HR 0,474; 95%ДИ: 0,219—1,026; p=0,058). Все это в совокупности, вероятно, может указывать на сходство клинического течения и исхода MMR-негативной/гетерогенной подгруппы с MMR-негативными опухолями и требует дальнейшего исследования целесообразности выделения MMR-негативного/гетерогенного фенотипа на выборках пациентов большего размера.

Напротив, подгруппа MMR-позитивных/гетерогенных опухолей продемонстрировала отличные от MMR-позитивного статуса более благоприятные клинико-морфологические характеристики (ассоциация с отсутствием перстневидных клеток, 1—2 макроскопическими формами по R. Bormann, папиллярным и тубулярным гистологическими подтипами по ВОЗ, 2019, с кишечным подтипом по P. Lauren, более высокой степенью дифференцировки и ранней стадией заболевания, см. табл. 2, рис. 4), а также тенденцию к более длительной выживаемости (медиана 61 мес против 36 мес, см. табл. 4). Необходимо учитывать гетерогенность клинико-морфологических параметров пациентов, входящих в подгруппы, выделенные на основе MMR-статуса, а именно значительный разброс по стадиям заболевания, статусу лимфатических узлов, наличию отдаленных метастазов внутри каждой из групп и, кроме того, отсутствие значимых различий по результатам многофакторного регрессионного анализа. В связи с этим наблюдаемые тенденции к различию выживаемости требуют валидации в дальнейших исследованиях на выборках пациентов с большей долей MMR-гетерогенных опухолей.

В РЖ сопоставление с клинико-морфологическими параметрами ранее не проводилось, в то время как в КРР гетерогенность MMR, по данным некоторых работ [5, 6], ассоциировалась с муцинозным строением опухоли, снижением дифференцировки, диффузным и гнездным ростом, перстневидными клетками. Возможно, в основе подобных несоответствий наших результатов данным литературы могут лежать различные патогенетические механизмы MMR-гетерогенности в РЖ и КРР, изучение которых не являлось предметом нашего исследования. В любом случае, очевидно, что этот феномен необходимо исследовать отдельно в зависимости от локализации опухоли.

MMR-гетерогенные опухоли в РЖ, выделенные из MMR-позитивных, потенциально могут рассматриваться как отдельная подгруппа, отличающаяся по клинико-морфологическому профилю и выживаемости от последних и более близкая к MMR-негативным опухолям. Однако необходимо учитывать малое количество наблюдений в группе MMR-негативных/гетерогенных опухолей, а также гетерогенность клинико-морфологических параметров пациентов, входящих в подгруппы, выделенные на основе MMR-статуса. В связи с этим наблюдаемые тенденции к различию выживаемости требуют подтверждения в дальнейших исследованиях на выборках пациентов с большей долей MMR-гетерогенных опухолей. Таким образом, в РЖ при наличии очагового окрашивания по одному или нескольким маркерам как при отсутствии полного выпадения маркеров MMR, так и при его наличии рекомендуется не классифицировать данные случаи как MMR-позитивные и MMR-негативные соответственно, а выделять их в отдельные подгруппы с последующим детальным изучением молекулярно-генетических изменений, особенностей ответа на иммунотерапию, иммунного портрета и клинических исходов.

Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда № 25-25-00636, https://rscf.ru/project/25-25-00636/.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Дресвянкина Э.Э., Данилова Н.В.

Сбор и обработка материала — Дресвянкина Э.Э., Чайка А.В., Хомяков В.М., Олейникова Н.А., Данилова Н.В.

Статистическая обработка данных — Дресвянкина Э.Э., Данилова Н.В.

Написание текста — Дресвянкина Э.Э.

Редактирование — Чайка А.В., Хомяков В.М., Олейникова Н.А., Данилова Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.