Имянитов Е.Н.

НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург

Выявление мутаций в гене BRAF для выбора терапии мела-номы

Журнал: Архив патологии. 2012;74(5): 65-71

Просмотров : 14

Загрузок :

Как цитировать

Имянитов Е. Н. Выявление мутаций в гене BRAF для выбора терапии мела-номы. Архив патологии. 2012;74(5):65-71.

Авторы:

Имянитов Е.Н.

НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург

Все авторы (1)

Эпидемиология меланомы

Меланома составляет не более 4% всех новообразований кожи, но на ее долю приходится примерно 80% случаев летальных исходов в онкодерматологии. В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности. Заболеваемость меланомой колеблется от ~1 до 55 случаев на 100 тыс. человек в год, в зависимости от географического расположения, поведенческих особенностей и расовой принадлежности изучаемой популяции. Индивидуальный риск данной патологии в развитых странах с преимущественно белым населением составляет около 2%. Пациенты с меланомой примерно на 10 лет моложе других онкологических больных: средний возраст на момент диагноза находится в интервале 50—55 лет. Меланома характеризуется весьма агрессивным течением и резистентностью к стандартной цитостатической терапии, поэтому 5-летняя выживаемость больных с метастатическим процессом не превышает 10—15% [30].

Заболеваемость меланомой проявляет устойчивую тенденцию к росту. Если рассматривать встречаемость меланомы в целом, то наибольшее число случаев, по-видимому, обусловлено эпизодической экспозицией представителей белой расы к большим дозам ультрафиолетового (UV) облучения. В процессе эволюции кожа человека освободилась от шерстяного покрова и поэтому выработала защитные барьеры, позволяющие снизить мутагенный эффект UV-облучения. В частности, у родоначальников человечества — представителей негроидной расы — кожа содержит «активный» вариант защитного пигмента, меланина. Меланин вырабатывается меланоцитами и проникает в расположенные по соседству кератиноциты. Данное вещество играет роль хромофора — оно абсорбирует на себя ультрафиолетовые лучи и свободные радикалы. Меланин встречается в различных изоформах, что, по крайней мере отчасти, обусловлено полиморфизмом рецептора меланокортина (MC1R). Исходный тип данного рецептора, продуцирующий т.н. эумеланин, обладает высокой способностью к поглощению ультрафиолета. В процессе миграции из Африки в северные регионы преимущество в отборе стали получать люди, способные усваивать достаточное количество ультрафиолета даже в странах с низкой солнечной инсоляцией — так возникла разновидность рецептора меланокортина, продуцирующая другую, неспособную к эффективной абсорбции УФ-лучей разновидность меланина — феомеланин [22].

Развитие человеческой цивилизации в последние 2—3 столетия сопровождалось массовым перемещением людей в непривычные климатические пояса. Неудивительно, что одним из главных последствий подобных переселений стало резкое увеличение частоты опухолей кожи. Так, если у проживающих в США негров встречаемость меланомы на 100 тыс. человек в год составляет примерно 1 случай, то аналогичный показатель для представителей европеоидной расы находится в пределах 20—30 [http://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html]. Примечательно, что заболеваемость меланомой слизистых оболочек, патогенез которой не связан с солнечной инсоляцией, является примерно одинаковой у представителей всех рас [32].

Однако главенствующую роль в росте частоты меланомы играет не столько эмиграция, сколько появившаяся с развитием авиации возможность регулярно посещать солнечные курорты и подвергаться интенсивному загоранию [18]. Например, в большинстве развитых стран Европы заболеваемость меланомой в конце прошлого века составляла 10—20 случаев на 100 тыс. человек в год, а в относительно бедных Белоруссии, Латвии, Литве, Сербии — не более 3. Интересно, что единственной профессиональной категорией людей, у которых увеличен риск меланомы, являются летчики и стюардессы — предполагается, что именно эти индивидуумы имеют наибольшие возможности для эпизодического интенсивного загорания [28]. Риск меланомы может заметно увеличиваться при злоупотреблении соляриями [12].

До 5% пациентов с меланомой сообщают о кровных родственниках, переболевших этим же заболеванием, — таким образом, соответствующий семейный анамнез является существенным фактором риска. Резкое повышение вероятности развития меланомы также отмечается у тех людей, которые уже переболели данной патологией. Это связано с тем, что среди пациентов наблюдается повышенное количество индивидуумов с неблагоприятным генотипом или историей избыточного UV-облучения [16, 28].

Заболеваемость меланомой ассоциирована с присутствием на коже множественных невусов. Наибольшая вероятность возникновения меланомы наблюдается у людей с бледными оттенками кожи, особенно у блондинов и рыжеволосых. Как упоминалось выше, решающим фактором риска развития меланомы является эпизодическое облучение интенсивными дозами ультрафиолета; в наибольшей мере роль опасных спектров солнечных лучей проявляется у тех индивидуумов, которые подверглись избыточной инсоляции в детском возрасте. Примечательно, что заболеваемость меланомой несколько выше у лиц с высоким социально-экономическим статусом — по-видимому, это связано с расширенными возможностями к путешествиям и посещению соляриев [5, 28].

Разновидности меланом

Меланома характеризуется значительной гетерогенностью молекулярного портрета, причем профиль генетических нарушений строго коррелирует с особенностями этиопатогенеза заболевания [10, 23]. Принято различать 5 основных групп меланом:

1) опухоли, возникшие на участках кожи, подвергавшихся хроническому солнечному облучению; эти новообразования характеризуются активацией генов клеточного цикла (cyclin D1, CDK4);

2) опухоли, развившиеся на скрываемых одеждой участках кожи; в данной категории меланом часто наблюдается активация сигнального каскада RAS-RAF-MEK-ERK, например за счет мутаций в генах NRAS и BRAF (рис. 1);

Рисунок 1. Пролиферативный сигнальный каскад, вовлеченный в молекулярный патогенез меланомы.

3) новообразования кистей и стоп, возникшие в переходных зонах эпителия; в них часто наблюдается активация рецептора KIT (рис. 1);

4) меланомы слизистых оболочек; для этой редкой категории новообразований также характерна активация рецептора KIT (рис. 1);

5) меланомы сетчатки, характеризующиеся мутациями в генах GNA11 и GNAQ.

BRAF как терапевтическая мишень

Онкоген BRAF кодирует молекулу, участвующую в передаче пролиферативного сигнала с мембранных тирозинкиназных рецепторов к ядру (рис. 1). Семейство киназ RAF представлено несколькими генами — ARAF, BRAF и CRAF. В нормальных тканях доминирующая роль в передаче сигналов принадлежит, по-видимому, CRAF. Тем не менее, активирующие мутации в опухолях поражают преимущественно BRAF; в этом случае именно BRAF становится главенствующим звеном соответствующего сигнального каскада, оттесняя CRAF на второй план. Изменения последовательности BRAF как правило затрагивают 600-й кодон и встречаются примерно в 50% меланом, в заметной доле случаев папиллярных опухолей щитовидной железы, а также в небольшом проценте новообразований толстой кишки, легкого и т.д. В то время как нормальный BRAF активируется только при поступлении сигнала от расположенного выше белка семейства RAS, повреждения гена BRAF приводят к автономной активации этой серин-треониновой киназы. В результате BRAF безостановочно передает стимулы к киназам MEK и ERK, которые играют ключевую роль в запуске процессов клеточного деления [11, 31].

Генетические повреждения BRAF стали вызывать огромный интерес в связи с появлением специфических ингибиторов мутированной изоформы упомянутого белка (PLX4032, GSK2118436). Наиболее изученным агентом этого класса является препарат вемурафениб (vemurafenib, PLX4032, Zelboraf). Терапевтическое использование данной молекулы приводит к уменьшению размеров меланомных очагов практически у всех пациентов, опухоль которых содержит мутацию, и сопровождается заметным увеличением времени до прогрессирования заболевания и общей выживаемости [8, 17, 38]. Столь выраженная клиническая эффективность Зелборафа в отношении практически некурабельной категории опухолей привела к его быстрой регистрации в США [http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/202429s000lbl.pdf] и Европе [http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/human/002409/WC500124317.pdf].

Необходимость отбора пациентов на лечение селективными ингибиторами мутированного BRAF

Вся совокупность предклинических и клинических данных указывает на то, что эффект селективных ингибиторов мутированной киназы BRAF ограничивается только теми пациентами, опухоль которых содержит мутацию [17]. Более того, воздействие этих же молекул на клетки с интактным BRAF сопровождается парадоксальной активацией каскада RAS-RAF-MEK-ERK; биохимические причины подобного феномена являются предметом интенсивных исследований [20, 21, 34]. Именно с таким неожиданным эффектом связывают наиболее необычный побочный эффект вемурафениба — появление плоскоклеточных карцином и, в редких случаях, меланома-подобных образований [17, 41]. Предполагается, что ошибочное назначение ингибиторов мутантного BRAF пациентам с нормальным внутриопухолевым статусом данного гена может сопровождаться ускорением роста меланомы!

Спектр мутаций BRAF

Развитие методов анализа последовательности ДНК позволило протестировать статус гена BRAF в десятках тысяч новообразований [http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=BRAF&start=1&end=767&coords=AA:AA]. В целом, мутации могут поражать различные области гена, однако подавляющее большинство из них затрагивает 600-й кодон [3]. До недавнего времени считалось, что доминирующей мутацией является 1799T>A, приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту (V600E). Примечательно, что единственная зарегистрированная для медицинского применения тест-система (Сobas 4800 BRAF V600 Mutation Test, http://molecular.roche.com/assays/Pages/cobas4800BRAFV600MutationTest.aspx) способна надежно распознавать лишь этот вариант мутации. Относительно недавние исследования установили, что до 20% замен в 600-м кодоне могут быть представлены другими вариантами — V600K (валин на лизин), V600R (валин на аргинин), V600D (валин на аспарагиновую кислоту) и V600M (валин на метионин) (табл. 1)

[1, 27, 29]. Клиническая эффективность ингибиторов BRAF пока убедительно доказана только для одной из «минорных» мутаций — V600K — хотя есть целый ряд оснований предположить чувствительность к лечению по крайней мере для некоторых (если не для всех) оставшихся вариантов мутированного BRAF [8, 36].

Проблема внутриопухолевой гетерогенности статуса BRAF

Аномалии этого онкогена могут обнаруживаться еще на стадии диспластического невуса; это свидетельствует о том, что самой по себе активации BRAF недостаточно для полной реализации злокачественного фенотипа [35]. Что же происходит с BRAF-мутированными клетками дальше, в ходе их злокачественной трансформации и метастазирования меланомы? Следует упомянуть, что вся идеология молекулярной онкологии основывается на клональном характере биологически значимых событий; подразумевается, что единожды приобретенная онкогенная мутация сохраняется во всех участках опухолевой ткани. Одним из наиболее неожиданных наблюдений последних лет представляется убедительная, хорошо воспроизводимая демонстрация внутриопухолевой гетерогенности меланомы в отношении статуса гена BRAF. Например, множественные биопсии разных участков одной и той же первичной опухоли зачастую приводят к получению дискордантных результатов анализа мутаций BRAF. Более того, повреждения BRAF могут не только приобретаться в процессе метастазирования (что вполне соответствует классическим представлениям о генетической эволюции опухолевого клона), но и утрачиваться при диссеминации клеток меланомы! Предполагается, что некоторые меланомы являются смесью BRAF-интактных и BRAF-мутированных опухолевых клонов [9, 25, 40].

Изложенные выше данные ставят новые, пока неразрешенные вопросы перед молекулярной диагностикой. Современные стандарты генетического анализа меланом подразумевают исследование всего одного биологического образца, вне зависимости от давности и анатомического места забора опухолевого материала. Сведения о молекулярной гетерогенности меланом указывают на возможную целесообразность повторных и множественных биопсий, представленных как первичной опухолью, так и метастатическими очагами. Еще более сложной является проблема выбора терапевтического решения в случае дискордантности статуса BRAF; следует напомнить, что назначение специфических ингибиторов BRAF может сопровождаться не только регрессом мутированных клонов опухоли, но и стимуляцией клеток меланомы с интактным BRAF.

Мутации BRAF и клинические характеристики меланом

Мутации в гене BRAF наблюдаются преимущественно в новообразованиях, возникающих на необлученных участках кожи. Тем не менее, из BRAF-тестирования не следует исключать опухоли с облучаемых участков кожи и слизистых, а также меланомы переходных зон эпидермиса — эти разновидности новообразований характеризуются весьма заметной частотой активации BRAF [24, 37]. Напротив, мутации BRAF почти никогда не встречаются в меланомах внутренних слизистых покровов, а также в опухолях сетчатки [14, 39].

Мутации BRAF могут быть ассоциированы с целым рядом клинических особенностей опухолей. Например, BRAF-мутированные меланомы чаще возникают у относительно молодых пациентов, отличаются частым метастазированием в лимфатические узлы и более агрессивным характером течения заболевания [3, 4, 6, 26].

Методы выявления мутаций BRAF

В качестве субстрата для молекулярно-генетического исследования выступают непосредственно трансформированные клетки — именно они содержат мутацию в гене BRAF. Поэтому одним из наиболее существенных условий получения правильного результата является качественная макро- или микродиссекция опухолевой ткани, позволяющая избежать значительной контаминации образца нормальными клетками. Наиболее удобным материалом для анализа служат обычные архивные биообразцы, зафиксированные в формалине и залитые в парафин. Следует прокомментировать, что неоправданно длительная фиксация ткани или использование незабуференного формалина могут приводить к необратимой деградации ДНК. К сожалению, именно меланомы являются наиболее трудным объектом для молекулярного анализа: считается, что высокое содержание меланина может затруднять амплификацию ДНК-фрагментов посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) [13]. Впрочем, это препятствие как правило успешно преодолевается простым разведением образца ДНК [19].

Практически любое молекулярное исследование предусматривает накопление ПЦР-продукта, содержащего 600-й кодон гена BRAF. Относительно недавно некоторые специалисты стали использовать модификацию ПЦР — т.н. COLD-ПЦР (co-amplification at lower denaturation temperature PCR; ко-амплификация при пониженных температурах денатурации); в данном случае ПЦР-протокол предусматривает небольшое снижение температуры плавления ДНК-фрагментов, что приводит к предпочтительной денатурации гетеродуплексов, и, как следствие, обогащению реакции мутированными последовательностями. Считается, что COLD-ПЦР может в определенной мере скомпенсировать недостаточное качество микродиссекции опухолевых клеток или выявить мутированную копию гена в новообразованиях с гетерогенным статусом BRAF [33].

Последнее время необыкновенную популярность приобрел метод HRM (high-resolution melting; высокоточный анализ кинетики плавления ДНК-фрагментов), позволяющий быстро и эффективно получать предварительные результаты о наличии или отсутствии мутации в исследуемом гене. Данный подход предусматривает медленное контролируемое нагревание двуцепочечных ДНК-фрагментов. Если в анализируемом гене присутствует мутация, то при соблюдении определенных условий ПЦР-продукты будут содержать гетеродуплексы, содержащие как минимум одну некомплементарную пару нуклеотидов. Подобные гетеродуплексы будут денатурироваться при чуть более низкой температуре, чем нормальные фрагменты ДНК; приборы, обладающие функцией HRM, способны выявлять эту разницу и таким образом отбирать аномальные последовательности для дальнейшего тестирования [33].

«Золотым стандартом» молекулярного анализа считается секвенирование ДНК. Этот метод основан на синтезе комплементарной ДНК-цепи на исследуемой одноцепочечной ДНК-матрице. Реакционная смесь содержит модифицированные терминирующие нуклеотиды, каждый из которых (аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т)) метится собственным флуоресцентным красителем. Электрофоретическое разделение ДНК позволяет определить идентичность терминирующего нуклеотида в каждом из синтезированных фрагментов, т.е. распознать фактическую нуклеотидную последовательность анализируемого ПЦР-продукта. Популярной модификацией классического автоматизированного секвенирования является т.н. пиросеквенирование. При выполнении этой методики каждый из нуклеотидов (А, Г, Т и Ц) поступает в реакционную смесь последовательно; в случае добавления «правильного» (комплементарного) нуклеотида происходит удлинение синтезируемого фрагмента на 1 звено, что сопровождается продукцией хемолюминесцентного сигнала. Считается, что пиросеквенирование обладает несколько большей способностью выявлять мутированный фрагмент в присутствии нормальных ДНК-последовательностей. Поистине революционным событием в биомедицине стала разработка технологии массивного параллельного секвенирования (massively parallel sequencing), которую часто называют секвенированием нового поколения (next-generation sequencing). Данный метод предусматривает многократное (100—500 раз) считывание одной и той же нуклеотидной последовательности, причем возможности соответствующих приборов допускают одновременный анализ миллиардов оснований ДНК. Подобные характеристики позволяют выполнять углубленный анализ биологического материала, в частности выявлять единичные мутированные клетки в присутствии громадного избытка (>99%) нормальных тканей. Помимо этого, массивное параллельное секвенирование предоставляет возможность выполнять одновременный анализ десятков генов в десятках биологических образцов [2, 15, 19].

Альтернативным секвенированию является метод аллель-специфической ПЦР. Его принцип заключается в использовании праймеров, специфических к нормальной и определенным мутантным последовательностям гена (рис. 2).

Рисунок 2. Принцип аллель-специфической ПЦР. В случае полной комплементарности праймера ДНК-матрице происходит накопление ПЦР-продукта (а); при несоответствии вариабельного нуклеотида эффективность ДНК-амплификации заметно снижается (б).
В случае полной комплементарности праймера ДНК-матрице (норма/норма или мутант/мутант) происходит накопление ПЦР-продукта; при несоответствии вариабельного нуклеотида эффективная ДНК-амплификация считается невозможной (рис. 2, 3).
Рисунок 3. Пример выявления мутации в гене BRAF посредством аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием красителя SYBR Green. Кривые на графиках отражают динамику накопления ПЦР-продукта в реакциях с праймерами, соответствующими нормальной или мутированной последовательности ДНК.
Аллель-специфическая ПЦР была изобретена более 20 лет назад, однако получение достоверных результатов стало возможным только после появления технологий мониторинга синтеза ПЦР-продукта в режиме реального времени (real-time PCR). Принцип аллель-специфической ПЦР лежит в основе большинства коммерческих наборов, в частности Сobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. Данная методика позволяет достоверно выявлять только те нуклеотидные замены, которые предусмотрены дизайном теста (например, только 1799T>A в случае Сobas). Аллель-специфическая ПЦР способна идентифицировать единичные мутированные копии гена в присутствии избытка нормальных последовательностей [2, 15, 19]. Недостатками метода являются относительно высокие требования к качеству исходного образца ДНК, а также определенный риск получения недостоверных или неинтерпретируемых результатов.

Относительно недавно в распоряжении морфологов появились антитела, специфические в отношении мутированной изоформы белка BRAF [7]. Единственным преимуществом иммуногистохимического метода определения мутаций BRAF является возможность его выполнения в обычной патоморфологической лаборатории. Однако, достоверность и межлабораторная воспроизводимость результатов, получаемых при использовании BRAF-антител, заметно уступает аналогичным показателям ДНК-анализа. Учитывая исключительную важность BRAF-теста, а также возможность транспортировки блоков в централизованные лаборатории для выполнения исследования, подмена молекулярно-генетического анализа иммуногистохимической процедурой представляется неприемлемой.

В табл. 2

систематизированы основные сведения о характеристиках методов, используемых при определении статуса BRAF.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail