Эпидемиология и диагностика мутаций в гене ALK у пациентов с немелкоклеточным раком легкого в Московской области

Белок ALK, кодируемый геном ALK, — это инсулинзависимый мембранный рецептор, содержащий внутриклеточный тирозинкиназный домен [1]. В норме он активно экспрессируется в нервной ткани только во время эмбрио- генеза, регулируя пролиферацию нейронов. Основной функцией этого рецептора является передача сигнала, а сигнальными путями — PI3K/ERK и RAS/MAPK [2].

Активация гена ALK при его перестройке происходит в результате образования химерных генов, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма. Роль транслокаций в онкогенезе известна достаточно давно. В течение длительного времени транслокации считались более характерными для опухолей кроветворной системы и сарком, чем для новообразований эпителиальной природы. В первую очередь это было связано с ограниченными возможностями существовавших ранее методов выявления транслокаций. В последние годы благодаря применению современных молекулярно-генетических методов доказано, что хромосомные перестройки не только являются нередким событием при солидных опухолях, но и зачастую играют ведущую роль в их развитии и прогрессии [3]. Так, обнаружение внутрихромосомной перестройки короткого плеча 2-й хромосомы, которое приводит к образованию химерного онкогена EML4/ALK при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), стало одним из важнейших шагов в расшифровке генома этого заболевания и расширении возможностей персонализации его лечения [4].

Исследования M. Soda и соавт. [5] показали ведущую роль этого генетического нарушения в онкогенезе для небольшой группы аденокарцином легких. Одновременно было высказано предположение о возможности блокирования химерного протеина с помощью ингибиторов тирозинкиназ. Образование химерного онкогена EML4/ALK приводит к активации гена ALK, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров. В такой ситуации ALK попадает под воздействие второго участника транслокации, становится независимым от своих лигандов и передает сигнал постоянно, нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки [6]. Как правило, в формировании транскрипта химерного гена участвует 20-й (редко 19-й) экзон ALK. Точка разрыва EML4 гораздо разнообразнее: описано как минимум 11 видов химерного транскрипта в зависимости от экзона этого гена, принимающего участие в его формировании.

В рамках программы RUSSCO «Совершенствование системы молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний в Российской Федерации» в период с 2014 по 2018 г. включительно было протестировано 488 пациентов в Московской области на наличие транслокации гена ALK с аденокарциномой легкого, имеющих отрицательный статус мутации EGFR. Исследования проводили в лабораториях, зарегистрированных в указанной программе. В данную выборку включены 174 женщины и 314 мужчин, их средний возраст составил 62,6 года; из них 232 человека курили на момент исследования или ранее, 124 не курили, а статус курения 132 был неизвестен.

Для обнаружения транслокации гена ALK использовали методы флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), иммуногистохимический (ИГХ) метод и в ряде случаев — полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Гистологическое исследование и ИГХ-анализ проводили по стандартным протоколам, ИГХ-реакцию — в автоматическом режиме с использованием автостейнера Ventana Bench Mark Ultra с моноклональными кроличьими антителами Ventanaanti-ALK (D5F3) и системой детекции Opti View DAB с применением Opti View Amplification Kit Ventana. Для оценки реакции использовали рекомендованную систему оценки в соответствии с инструкцией производителя.

Транслокации с участием гена ALK детектировали с помощью флюоресцентного зонда Vysis LSI ALK Break Apart Rearrangement Probe Kit (Abbott Molecular, США). Результат оценивали, используя флюоресцентный микроскоп.

Выявляли мутации в гене ALK в ткани РЛ с помощью метода ПЦР в режиме реального времени и рекомендованного набора реагентов согласно протоколу производителя. ДНК из парафиновых блоков выделяли, применяя стандартный набор.

Определение транслокации гена ALK вошло в рутинную клиническую практику и позволяло врачам назначать соответствующее персонализированное лечение. Так, в период с 2014 по 2018 г. включительно было протестировано 488 пациентов из Московской области в рамках программы RUSSCO «Совершенствование системы молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний в Российской Федерации». В 2014 г. протестировали всего 12 пациентов, не имеющих мутаций в гене EGFR, а в 2018 г. это количество возросло до 174 человек (рис. 1, табл. 1).

Частота встречаемости транслокаций с участием гена ALK при НМРЛ, по данным разных авторов, колеблется от 3 до 13% в зависимости от особенностей выборки [1].Так, в Московской области за исследуемый период выявлено 38 ALK-положительных пациентов из 488 обследованных, что в среднем составило 7,6% (рис. 2).

Известен ряд признаков, которые, по данным ранее проведенных исследований, ассоциированы с высокой частотой встречаемости перестроек гена ALK. Более чем в 50% перестроек обнаруживается преимущественно солидный или ацинарный тип строения опухоли, гораздо реже — папиллярный и крайне редко — муцинпродуцирующий тип аденокарциномы. Также имеется тенденция ALK-позитивных опухолей к метастазированию в лимфатические узлы и головной мозг [1, 7]. Кроме того, в 73,1% случаев ALK-положительных аденокарцином экспрессируется TTF1. Еще одной особенностью является относительно молодой возраст и статус курения обследуемых, т.е. никогда не курившие или курившие мало [8]. В нашем исследовании 65,8% пациентов с транслокацией гена ALK составили женщины, большинство которых никогда не курили (72%). В группе ALK-отрицательных случаев превалировали мужчины (66,9%), причем большая часть из них на момент исследования курили (табл. 2). Возраст во всех группах был примерно одинаковый.

На сегодняшний день разработано достаточно большое количество разнообразных тестов для обнаружения транслокации гена ALK. Например, в Московской области из 488 пациентов в 397 случаях использовали ИГХ-метод, при этом только в 13 сомнительных случаях понадобилось проведение FISH-исследования. В 91 случае применяли молекулярно-генетические методы: флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) в 77 и ПЦР в 14.

В настоящее время именно ИГХ-метод широко используется для первичного скрининга образцов НМРЛ, в том числе и в Московской области (81,3% больных). Следует отметить, что наличие артефактов и/или сомнительных результатов в 3,3% случаев потребовало применение альтернативных методов (как правило, FISH) для точной детекции транслокации (рис. 3).

Еще одной методикой, используемой для обнаружения реаранжировки гена ALK, является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). В Московской области ее применяли в 13 сомнительных случаях после ИГХ-метода и 77 случаях сразу после определения статуса гена EGFR. Проба представляет собой два флюоресцентных зонда, конъюгированных с красителями разного цвета (оранжевым и зеленым) и комплементарных расположенным рядом последовательностям гена ALK. В норме оба зонда гибридизуются рядом и формируют сигнал желтого цвета или расположенные вплотную два сигнала красного и зеленого цвета. При перестройке гена и перемещении одной из его последовательностей сигналы расходятся и видны как лежащие раздельно. Такая методика позволяет распознать все виды перестроек гена ALK вне зависимости от партнера транслокации, что и является ее основным преимуществом (рис. 4). Недостатками метода являются его высокая стоимость и высокие требования к качеству образца и количеству опухолевых клеток в нем, поскольку для получения достоверного результата необходимо просмотреть не менее 50 ядер [9].

ПЦР-метод обладает высочайшей чувствительностью, позволяет работать с образцами, содержащими низкое количество опухолевых клеток, способен сразу идентифицировать тип перестройки. Однако имеет и определенные недостатки, такие как требования к качеству материала и возможность выявить только те типы перестройки гена ALK, к которым подобраны специфические праймеры [10].

В рамках программы RUSSCO «Совершенствование системы молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний в Российской Федерации» в Московской области был использован следующий алгоритм диагностики по выявлению транслокации гена ALK у пациентов с НМРЛ, который представлен на рис. 5.

В ряде исследований показано, что различные тесты, используемые для выявления перестройки гена ALK, полностью между собой согласуются [6, 10].

Таким образом, приведенный выше алгоритм позволил выявить перестройку гена ALK в популяции больных с аденокарциномой легкого в Московской области в среднем в 7,6% случаев. При этом ИГХ-метод является основным и используется более чем в 80% случаев. Следует отметить, что применение других методов для верификации нарушений в гене ALK было необходимо в редких случаях (3,3%). Разработанный алгоритм позволяет оптимизировать диагностические исследования для назначения таргетной терапии немелкоклеточного рака легкого.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.А.Ф., Е.Н.И., С.А.Т.

Сбор и обработка материала — Н.М.М., Н.А.С., И.А.Д., М.М.Б

Написание текста — М.М.Б., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Редактирование — Т.В.К.,В.В.К., Н.А.С., И.А.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.