Кириченко Е.Ю.

НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета

Жукова Г.В.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Григоров С.В.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Гранкина А.О.

НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета

Атмачиди Д.П.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Особенности экспрессии коннексина-36 и некоторых нейроглиальных антигенов в астроцитарных опухолях головного мозга

Журнал: Архив патологии. 2015;77(3): 23-29

Просмотров : 26

Загрузок : 2

Как цитировать

Кириченко Е. Ю., Жукова Г. В., Григоров С. В., Гранкина А. О., Атмачиди Д. П. Особенности экспрессии коннексина-36 и некоторых нейроглиальных антигенов в астроцитарных опухолях головного мозга. Архив патологии. 2015;77(3):23-29. https://doi.org/10.17116/patol201577323-29

Авторы:

Кириченко Е.Ю.

НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета

Все авторы (5)

Ведущее место злокачественных глиом в структуре нейроонкологических заболеваний, высокая частота рецидивов и низкая выживаемость больных определяют актуальность исследования механизмов развития этих опухолей. В настоящее время глиальные опухоли рассматриваются как системное заболевание ЦНС, патогенез которого может быть связан с нарушением межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов [1—3]. Как известно, щелевые контакты представляют собой гексаметрические структуры, сформированные белками-коннексинами, которые напрямую соединяют цитоплазмы соседних клеток, обеспечивая непосредственный обмен химическими регуляторными сигналами [4, 5]. При этом имеются сведения также и о самостоятельной противоопухолевой активности некоторых белков-коннексинов, обусловленной взаимодействием их карбоксильных С-концов с веществами, участвующими в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза [6 и др.].

Данные об изменениях щелевых контактов при развитии глиальных опухолей мозга человека немногочисленны, в значительной своей части получены в исследованиях на культурах клеток и противоречивы [7, 8]. Кроме того, в доступной литературе практически отсутствуют сведения об экспрессии в астроцитарных опухолях головного мозга коннексина-36 (Сх36) — структурного белка нейрональных щелевых контактов. Большое значение данных о наличии и состоянии нейронального компонента глиальных опухолей для понимания их патогенеза обусловлено тесной структурно-функциональной связью нейронов и клеток глии, совместно формирующих ансамблевую организацию мозга и обеспечивающих его функционирование и нейропластичность [9].

Целью настоящей работы явились иммуногистохимическое (ИГХ) исследование нейронального Сх36, а также анализ соотношения экспрессии Сх36 и нейроглиальных антигенов в астроцитарных опухолях головного мозга человека различной степени злокачественности.

Материал и методы

Материалом для исследований служили фрагменты астроцитарных опухолей головного мозга человека, локализованных преимущественно в лобных долях, резецированные оперативным путем. Опухоли различались по степени злокачественности и включали астроцитомы (Grade 2, n=3), анапластические астроцитомы (Grade 3, n=6) и глиобластомы (Grade 4, n=7), а также фрагменты ткани, окружающей опухоль (n=4). Исследование было проведено в соответствии с лицензией №ФС-61−01−001694 от 06.09.2011 в рамках государственного задания ФГБУ РНИОИ на 2012—2016 гг. «Изучение патогенеза злокачественных новообразований с использованием лекарственных средств и физических методов воздействия». Наряду с ИГХ-исследованием экспрессии Cx36 в тех же образцах проводилось исследование экспрессии стандартных ИГХ-маркеров, характерных для нервной ткани — синаптофизина и белка нейрофиламентов, а также глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике [10, 11]. Срезы размером 4 мкм изготавливали на микротоме Leica (Германия). После стандартной процедуры депарафинирования, дегидратации проводили тепловую демаскировку антигенов. Для ИГХ-исследования срезов использовали первичные мышиные моноклональные и кроличьи поликлональные антитела — Neurofilament, mouse, clone 2F11 («Dako», Дания); Glial fibrillar Acid Protein (GFAP), mouse; clone 6F2 («Dako», Дания); Synaptophysin, mouse, clone SY38 («Dako», Дания); anti-Connexin 36 (Сх36), rabbit polyclonal («Invitrogen», США) и систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (DAB), «Dako» (Германия). После проведения ИГХ-реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином. Для количественной оценки плотности расположения клеток и особенностей экспрессии ИГХ-маркеров использовали программу для морфометрии Leica Application Suite 4.3 («Leica», Германия).

Методическая задача данного исследования состояла в выборе оптимального режима проведения ИГХ-реакций на выявление Сх36 в соответствии с известными данными литературы [4, 12].

Результаты и обсуждение

После серии ИГХ-окрашиваний на образцах положительного контроля (фрагменты поджелудочной железы человека) было показано, что тепловая обработка ткани при pH 9,0 наравне с энзимной при использовании антител к Сх36 приводит к сильному фоновому окрашиванию и зачастую к негативной реакции на данный антиген. Применение цитратного буфера с рН 6,0 позволило получить специфическую реакцию на тестируемых образцах положительного контроля, в то время как на образцах ткани отрицательного контроля (для Сх36 фрагменты печени крысы) реакция оставалась негативной. В итоге для поликлонального антитела anti-Connexin 36 («Invitrogen», США) оптимальные рабочие концентрации были получены при разведениях 1:150 и 1:200, оптимальное время инкубации составило 48 ч при температуре 2—4 °C во влажной камере, а в качестве способа демаскировки была использована тепловая обработка в цитратном буфере c pH 6,0.

При изучении ткани мозга, окружающей опухоль (ткани перифокальной зоны), были отмечены многочисленные астроциты, отличавшиеся крупными размерами, значительным числом ветвящихся отростков, экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) (рис. 1, а). К характерным особенностям микрокартины перифокальной зоны следует также отнести выраженную экспрессию синаптофизина, наличие заметных при большом увеличении (×1000) групп и цепочек ядер нервных клеток, располагавшихся вблизи зон интенсивного выпадения продукта реакции, т. е. в участках с высоким содержанием синаптофизина. При этом вокруг некоторых нейронов гранулы хромогена образовывали подобие ярко окрашенного ободка, что указывает на скопление химических синапсов с большим числом синаптических везикул (см. рис. 1, б).

Рис. 1. Экспрессия нейрональных и глиальных антигенов в образцах глиальных опухолей человека. а — экспрессия GFAP в ткани, окружающей опухоль. × 400; б — экспрессия синаптофизина (SYN) в ткани, окружающей опухоль. ×400; в — экспрессия Сх36 в ткани, окружающей опухоль. ×400; г — астроцитома Grade 2, окраска гематоксилином и эозином, ×400; д — экспрессия Сх36 в образцах астроцитомы Grade 2. ×400; е — цитоплазматическая реакция Сх36 в астроцитоме Grade 3. ×1000.

После проведения ИГХ-реакций с антителом к Сх36 во всех образцах (n=4) в ткани перитуморальной зоны была выявлена положительная реакция на плазмалемме тел крупных и мелких пирамидных нейронов, на их отростках, в цитоплазме, а также в окружающем нейропиле. Следует отметить наиболее выраженную экспрессию этого протеина на восходящих радиальных отростках пирамидных клеток (см. рис. 1, в). В некоторых случаях при большом увеличении визуализировались скопления многочисленных ярко окрашенных срезанных мелких отростков — аксонов и дендритов с высоким уровнем экспрессии Сх36. Присутствие Сх36 было выявлено приблизительно в 60% клеток, имевших морфологические признаки нейронов. При этом длина мелких окрашенных отростков варьировала в диапазоне от 8 до 32 мкм, а длина позитивно окрашенных восходящих коллатералей составляла 13—24 мкм.

Наряду с позитивно окрашенными нейронами при большом увеличении выявлялись мелкие глиоциты, отрицательные к Сх36. В целом экспрессия Cx36 была менее выражена, чем экспрессия двух других нейрональных антигенов (синаптофизина, нейрофиламентов), и при большом увеличении выглядела как точечная или зернистая. Это может быть обусловлено размером белков-коннексинов щелевых контактов и полуканалов, определяющих характер выпадения хромогена.

Переходя к анализу результатов ИГХ-изучения ткани глиальных опухолей, необходимо отметить, что во всех исследованных образцах наблюдалась выраженная равномерная гомогенная положительная экспрессия GFAP. Это соответствует данным литературы о распределении GFAP в этих опухолях [13, 14].

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, астроцитомы Grade 2 были представлены дискретно расположенными опухолевыми астроцитами с относительно мономорфными ядрами, фигуры митозов и пролиферация эндотелия сосудов при этом отсутствуют (см. рис. 1, г). Во всех образцах астроцитом (Grade 2) в многочисленных клетках и отростках в нейропиле была отмечена отчетливая реакция с антителами к белкам нейрофиламентов и синаптофизину. Исследование экспрессии Сх36 в этих же опухолях выявило интенсивную реакцию на мембране тел и отростков и умеренную цитоплазматическую реакцию клеток (см. рис. 1, д). При этом наблюдалась коэкспрессия Сх36 и синаптофизина на одних и тех же клетках и их отростках, что свидетельствует о сохранении взаимного расположения химических синапсов и щелевых контактов в глиальных опухолях низкой степени злокачественности.

В отличие от астроцитом, в исследованных образцах анапластических астроцитом (Grade 3) наблюдалась фокальная экспрессия синаптофизина. В нейропиле встречались локусы как интенсивной, так и слабо выраженной реакции. Экспрессия нейрофиламентов также была выражена слабее, чем в астроцитомах. Были отмечены лишь единичные сохранившиеся отростки нейронов, которые имели вид гетерогенных по интенсивности продольных линий и скоплений гранул, сосредоточенных вокруг тел нейронов, также снижено было и содержание Сх36. Выявлялась гетерогенная по выраженности экспрессия этого белка в клетках, а также на некоторых участках в нейропиле. При большом увеличении были отмечены клетки с локализацией Сх36 как на мембране, так и в цитоплазме их тел и отростков (n=6) (см. рис. 1, е). В случаях анапластических астроцитом практически не наблюдалась коэкспрессия синаптофизина и Сх36, что также указывало на более значительную структурную дезорганизацию ткани мозга по сравнению с отмеченной в астроцитомах Grade 2.

В отличие от астроцитом, глиобластомы при морфологическом исследовании характеризовались множественными очагами коагуляционного некроза, наличием псевдопалисадных структур, которые были представлены несколькими рядами вытянутых клеток с гиперхромными ядрами, также наблюдалась выраженная пролиферация эндотелия сосудов (рис. 2, а). В целом такая картина характерна для этого типа опухолей [15, 16]. Реакция на Сх36 во всех образцах глиобластом была позитивной, визуализировались многочисленные веретеновидные клетки с гиперхромными мультиформными мелкими ядрами (см. рис. 2, б). Отчетливое окрашивание наблюдалось как на мембранах клеток, так и в нейропиле. На фоне большого количества мелких клеток были заметны крупные, местами гигантские полиморфные клетки с темными неправильной формы ядрами, демонстрировавшие экспрессию Сх36 в цитоплазме (см. рис. 2, в). В зонах диффузного роста опухоли клетки, отчетливо экспрессирующие Сх36 в цитоплазме, располагались в слабо окрашенном нейропиле (см. рис. 2, г). В псевдопалисадах экспрессия Сх36 выявлялась в виде глыбчатой или мелкозернистой преимущественно цитоплазматической реакции (см. рис. 2, д, е).

Рис. 2. Экспрессия Сх36 в глиобластомах. а — астроцитома Grade 4 (глиобластома), окраска гематоксилином и эозином. ×200; б — диффузная экспрессия Сх36 в веретенообразных клетках. ×400; в — крупные клетки, экспрессирующие Сх36 в цитоплазме. ×1000; г — выраженная экспрессия Сх36 в нейронах и слабая в нейропиле. ×400; д — мелкозернистая реакция на Сх36 в псевдопалисадах. ×400; е — фрагмент рисунка д. ×1000.

Глиобластомы характеризовались заметным снижением экспрессии всех нейрональных маркеров. При этом исследованные образцы по уровню и сочетанию экспрессии синаптофизина и нейрофиламентов разделились на три варианта. Первый вариант характеризовался одинаково выраженной экспрессией этих двух нейрональных маркеров (n=3) (рис. 3, а, б). При втором варианте наблюдалась положительная реакция на нейрофиламенты при отрицательной реакции на синаптофизин (n=2) (см. рис. 3, в, г). В двух случаях, отнесенных к третьему варианту, было отмечено практически полное отсутствие экспрессии как синаптофизина, так и нейрофиламентов (см. рис. 3, д, е). При этом выраженность экспрессии Сх36 заметно снижалась от первого к третьему ИГХ-варианту, но оставалась положительной. Можно предположить, что наличие нескольких ИГХ-вариантов глиобластом отражает различие в степени малигнизации и может иметь диагностическое и прогностическое значение.

Рис. 3. Экспрессия синаптофизина и нейрофиламентов в образцах глиальных опухолей человека Grade 4 (глиобластомах). а, б — первый вариант экспрессии: наблюдается экспрессия обоих белков — синаптофизина и нейрофиламентов. ×400; в, г — второй вариант экспрессии: положительная экспрессия только на нейрофиламенты. ×400; д, е — третий вариант экспрессии: отсутствие экспрессии синаптофизина и нейрофиламентов. ×200.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о снижении в глиальных опухолях уровня экспрессии как основных нейрональных маркеров, так и Сх36 по мере увеличения степени их злокачественности (см. таблицу).

Экспрессия Cx36 в астроцитомах человека различной степени злокачественности

Кроме того, в глиобластомах, как и во всех других исследованных образцах ткани мозга, реактивность Сх36 варьировала от точечной гранулированной мембранной реакции до диффузной цитоплазматической. Известно, что точечная локализация Сх36 на плазмалеммах тел и отростков клеток может отражать формирование щелевых контактов и полуканалов, функционирующих как ионные каналы [17]. При этом на данном этапе исследований остается открытым вопрос о характере этого процесса (компенсаторном или патологическом) на разных стадиях малигнизации, а также об участии цитоплазматического пула Сх36 в развитии злокачественного процесса.

Заключение

Результаты ИГХ-исследования для выявления Сх36 в глиобластомах существенно дополняют известные сведения литературы об иммунопозитивности нейронных маркеров в глиомах высокой степени злокачественности. Высокая реактивность антител к Сх36 ставит вопрос об их использовании для выявления новых эффективных показателей диагностики и прогноза развития первичных опухолей головного мозга. Новые сведения о снижении содержания исследованных нейрональных белков, об особенностях их распределения и о нарушении коэкспрессии синаптофизина и Сх36 по мере повышения степени злокачественности глиальных опухолей, а также об ИГХ-гетерогенности глиобластом расширяют представления о патогенезе опухолей мозга и определяют направление дальнейших исследований.

Работа поддержана грантом ФЦП № 14.578.21.004 «Разработка полногеномных молекулярных карт для выявления новых терапевтических мишеней».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.Ю.К., Г.В.Ж., С.В.Г. 

Сбор и обработка материала: Г.В.Ж., С.В.Г. , Д.П.А., Е.Ю.К., А.О.Г. 

Статистическая обработка данных: Е.Ю.К.

Написание текста: Е.Ю.К., Г.В.Ж.

Редактирование: Г.В.Ж., А.О.Г. 

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail