Экспрессия антиапоптотического протеина сурвивина и его гена в первичной карциноме молочной железы

Сурвивин — белок, кодируемый у людей геном BIRC5, получил название «бакуловирусный протеин» [1, 2]. Сурвивин — член семейства белков ингибиторов апоптоза (IAP). Основная функция белка сурвивина заключается в том, чтобы запретить каспазную активацию апоптоза. Экспрессия генов BIRC5 высокая в период внутриутробного развития и при развитии большинства опухолей, при этом содержание его ничтожно мало в дифференцированной ткани [3]. Экспрессия гена сурвивина четко отрегулирована клеточным циклом. Установлено, что экспрессия гена BIRC5 и синтез сурвивина связаны с белком p53 [4]. Экспериментальные исследования показали, что сурвивин ингибирует апоптоз, останавливая как внешний, так и внутренний путь связывания и ингибирования эффекторных каспаз 3 и 7 [5].

Экспрессия гена сурвивина особенно выражена во время эмбрионального развития, а также в большинстве типов клеток опухоли и редко присутствует в нормальных, доброкачественных взрослых дифференцированных клетках.

Белок сурвивин может быть расценен как онкоген, поскольку его сверхэкспрессия в большинстве раковых клеток способствует их сопротивлению апоптотическим стимулам и химиотерапевтическим методам лечения, таким образом способствуя продолжающемуся выживанию и прогрессированию.

Цель исследования — изучить экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, а также гена BIRC5, его кодирующего, в первичной карциноме молочной железы как потенциального прогностического и предиктивного маркера.

Исследовали 67 образцов (биоптатов) первичной карциномы молочной железы, полученные в ходе оперативного вмешательства или трепан-биопсии опухоли у пациенток с верифицированным резектабельным первичным раком молочной железы (РМЖ) стадии pT1−4N3cM0.

Наряду со стандартным иммуногистохимическим (ИГХ) исследованием экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, а также рецептора эпидермального фактора роста была исследована экспрессия антиапоптотического белка сурвивина. Использовали антитело Susvivin Antibody Biоtin conjugate («Pierce», Франция), а также систему для автоматической визуализации BOND Polymer Detection Systems («Leica Microsystems», Германия). Окрашивание проводили в автоматическом режиме на иммуностейнере фирмы «Leica Microsystems». Дальнейшее изучение микропрепаратов и их оценку осуществляли на микроскопах фирмы «Leica».

Использовали ИГХ-исследование экспрессии антиапоптотического протеина сурвивина в ткани карциномы, с помощью обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени исследовали нормализованную экспрессию гена BIRC5, кодирующего белок сурвивин. Полученный в ходе биопсии или оперативного вмешательства образец опухоли в объеме до 5 мм³ замораживали, затем измельчали, лизировали. Выделение мРНК из лизированных клеток проводили в соответствии с инструкциями производителя наборов для выделения РНК (ООО «СИВитал», Беларусь). Используя технологию обратной транскрипции, синтезировали кДНК, которую применяли в последующем для анализа экспрессии гена BIRC5 в режиме реального времени ОТ-ПЦР. Расчет нормализованной экспрессии проводили относительно уровня экспрессии референсного гена «домашнего хозяйства» с-ABL.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к проведению медико-биологических исследований. Качественные показатели представлены абсолютными и относительными величинами. Количественные признаки, не подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде медианы (Ме), интерквартильного диапазона (LQ/UQ), минимального и максимального значений (min, max). В качестве меры связи для количественных признаков, не подчиняющихся нормальному закону распределения, рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Все значения р были двусторонними. Статистическую обработку результатов провели с использованием программы SPSS Statistics 10.0.

Учитывая тот факт, что в настоящее время отсутствуют ИГХ-критерии оценки уровня экспрессии сурвивина как, например, для рецептора эпидермального фактора роста Her2-neu, оценку экспрессии таргетного антигена проводили по принципу да/нет, т. е. имеется экспрессия данного протеина в клетках или нет.

Экспрессию сурвивина определяли в 47 образцах карциномы молочной железы, что составило 70,15%.

Клинико-анатомическая характеристика опухолевого процесса, а также патоморфологическая характеристика образцов первичных карцином, в которых с помощью ИГХ-исследования определили экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, представлены в табл. 1 и 2

При анализе клинико-анатомических характеристик опухоли и экспрессии сурвивина в опухолевой ткани каких-либо статистически значимых зависимостей и корреляций выявлено не было.

Наибольший интерес представляет изучение экспрессии сурвивина в сравнении с известными прогностическими маркерами, определяемыми в опухолевой ткани, главным образом такими, как гистологический тип опухоли, молекулярно-биологический подтип опухоли, степень дифференцировки, лимфососудистая инвазия, индекс пролиферативной активности и др. (см. табл. 2).

Из представленных в табл. 2 данных видно, что экспрессия антиапоптотического белка сурвивина определялась наиболее часто в протоковой карциноме средней и высокой степени злокачественности и главным образом сочеталась с лимфовенозной стромальной инвазией.

Следует отметить, что экспрессия белка сурвивина коррелировала с экспрессией рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu. Наиболее часто сурвивин экспрессировался в опухолях, не экспрессирующих HER2-neu (r=0,113; p>0,05).

Интересна полученная информация о взаимосвязи экспрессии сувивина и индекса пролиферативной активности Ki-67. Так, например, в 59,6% случаев сурвивин экспрессировался в опухолях с низким показателем Ki-67 — меньше 15%.

Несмотря на то что данные статистически недостоверны как в отношении экспрессии HER2-neu, так и Ki-67 (p>0,05) и корреляционная зависимость слабая, данный факт может свидетельствовать о том, что опухоли, экспрессирующие сурвивин, находятся в особом состоянии, в стадии не активной пролиферации, а в состоянии ингибирования апоптоза. Графическое изображение сочетания экспрессии сурвивина и молекулярно-биологического подтипа опухоли представлено на рис. 1.

Качественная оценка экспрессии белка сурвивина имеет также определенное значение с точки зрения понимания функции данного протеина и возможных потенциальных механизмов воздействия на данный сигнальный путь.

Так, при ИГХ-исследовании установлено, что белок сурвивин экспрессировался преимущественно в цитоплазме опухолевых клеток первичной карциномы молочной железы (рис. 2, 3).

Также при помощи ОТ-ПЦР в режиме реального времени исследована экспрессия гена сурвивина BIRC5 в 67 образцах первичной карциномы молочной железы. Во всех без исключения образцах опухолевой ткани определялась экспрессия гена BIRC5, однако уровни рассчитанной нормализованной экспрессии относительно уровня экспрессии референсного гена c-ABL варьировали в широком диапазоне (рис. 4).

Показатели нормализованной экспрессии гена BIRC5 в первичной карциноме молочной железы (ОТ-ПЦР): медиана — 1,49, min — 0,015, max —30, 40, LQ — 0,662, UQ — 13,5.

Результаты корреляционного анализа приведены в табл. 3.

При анализе представленных данных установлено, что уровень нормализованной экспрессии гена BIRC5 достоверно умеренно коррелирует с экспрессией собственного продукта белка сурвивина (r=0,704; p<0,01) и слабо отрицательно коррелирует c экспрессией онкопротеина HER2-neu (r=–0,285; p<0,05).

I. Tamm и соавт. [5] показали, что уровень сурвивина повышен во всех 60 различных линиях опухоли человека. В литературе [6] имеются сведения, что инактивация сурвивина в раковых клетках позволяет остановить формирование микроканальцев, что приводит к полиплоидии, а также к крупному апоптозу. Еще одной из важных функций сурвивина является регулирование уровня p53. Известно, что особенность большинства опухолей со сверхэкспрессией сурвивина — полная потеря дикого типа p53 [7]. В то же время исследования A. Mirza и соавт. [7] доказывают, что существует связь между уровнем сурвивина и p53. Дикий тип p53 подавлял экспрессию сурвивина на уровне мРНК как в клетках рака легкого, так и в клетках РМЖ.

При исследовании образцов крови от пациентов, страдающих раком, ученые нашли антитела, которые являются специфическими для сурвивина и отсутствуют у здоровых людей. Измерение уровня сурвивин-определенных антител в крови пациента является мониторингом развития опухоли, а определение экспрессии сурвивина при всех наиболее распространенных злокачественных опухолях (рак легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, простаты, молочной железы, сарком мягких тканей, Т-клеточного лейкоза) позволяет прогнозировать риск смерти [8]. Кроме того, исследования показали, что клетки РМЖ, гиперэкспрессирующие ген эпидермального фактора роста HER2-neu, имели более высокие уровни сурвивина, которые коррелировали с увеличенным сопротивлением таксанвызванному апоптозу. В то же время комбинация таксанов с ингибитором сурвивина привела к увеличенному апоптозу в HER2-гиперэкспрессирующих клетках РМЖ по сравнению с монотерапией [9, 10].

Полученные данные по исследованию экспрессии гена BIRC5 и его белкового продукта семейства ингибиторов апоптоза протеина сурвивина позволяют рассматривать данный ген и его продукт как один из опухолеспецифических маркеров опухолевой ткани карциномы молочной железы. Его положительная корреляционная связь с известным прогностическим фактором, таким как экспрессия онкопротеина рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu (r=–0,285; p<0,05), и активная транскрипция кодирующего гена (r=0,704; p<0,01) позволяют рассматривать белок сурвивин и ген BIRC5, его кодирующий, как неблагоприятный прогностический фактор и использовать его в качестве предиктивного маркера ответа на химотерапию, в том числе и таргетную.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.А.Ш., А.В.К.

Сбор и обработка материала — Е.А.Ш., А.В.К.

Статистическая обработка — Е.А.Ш.

Написание текста — Е.А.Ш.

Редактирование — Е.А.Ш.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Шляхтунов Евгений Александрович — канд. мед. наук, доцент каф. онкологии;e-mail: Evgenij-shlyakhtunov@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5906-5373

Клопова В.А, https://orcid.org/0000-0002-1401-1021