Экспрессия маркеров апоптоза и аутофагии в перевитом раке почки у крыс при введении флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (L.)

На сегодняшний день количество пациентов с онкологическими заболеваниями продолжает увеличиваться, а современные методы лечения не всегда оказываются эффективными [1]. Кроме того, недостатками применяемых противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на неизмененные органы и ткани организма, а также развитие к ним устойчивости опухолей [2]. Все это делает необходимым поиск новых, более безопасных и эффективных лекарственных препаратов.

Лекарственные средства растительного происхождения имеют минимальные побочные эффекты, поэтому им сегодня уделяется особое внимание. Препараты из растительного сырья могут использоваться не только для лечения опухолей в виде монотерапии, но и в комплексном лечении для защиты нормальных клеток (в том числе и стволовых клеток костного мозга) при проведении стандартного курса химио- и лучевой терапии [1—3].

Самой перспективной группой препаратов из растительного сырья, по мнению ряда авторов, являются флавоноиды, так как они обладают наибольшим количеством биологических эффектов, оказывающих положительное влияние на результаты лечения новообразований [2, 3]. Открытие в 2011 г. способности растительного флавоноида вогонина активизировать апоптоз в опухолевых клетках [4] позволило продолжить поиск и других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Ранее на лабораторных животных с перевиваемыми опухолями было показано, что флавоноидсодержащий экстракт аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) наряду с малой токсичностью обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемого рака печени и саркомы, а также антиоксидантным и антикахексическим свойством [5—7]. Однако детального изучения апоптоза, аутофагии и механизмов гибели опухолевых клеток перевиваемого рака почки с применением иммуногистохимических маркеров под действием экстракта аврана ранее не проводилось.

Цель исследования — в экспериментах in vivo установить механизмы патоморфоза перевитого рака почки под влиянием флавоноидсодержащего экстракта аврана.

Экстракты были получены авторским способом (патент РФ № 2482863), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предусматривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [8]. Экстракт аврана лекарственного, полученный данным способом, имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин [8].

Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащих Женевской конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Тема и описания экспериментов одобрены этической комиссией ФГБОУ ВО «СГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России (протокол № 13 от 03.05.11). Исследование проведено на базе Центра коллективного пользования НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии, ФГБОУ ВО «СГМУ им В.И. Разумовского» Минздрава России.

В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [9], использованы 30 самцов белых лабораторных крыс Wistar массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в область лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси рака почки РА в растворе Хэнкса. Опухоль получена из банка опухолевых штаммов ГУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Животные с перевитым раком методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: 1-я и 2-я — опытные, крысы получали экстракт аврана либо перорально, либо внутримышечно в дозе 110 мг сухой массы экстракта на 1 кг, 3-ю группу (сравнения) составили животные с перевиваемой опухолью, но без введения экстракта. В опытных группах через 72 ч после трансплантации опухоли крысам раствор вводили ежедневно в течение 2 нед, после чего животных всех групп выводили из эксперимента путем декапитации под наркозом (золетил 10 мг /кг подкожно) и проводили забор образцов ткани опухоли.

Известно, что эффективность противоопухолевой терапии оценивается по степени выраженности патоморфоза, который проявляется дистрофией, некрозом, склерозом, а также развитием атрофических изменений в ткани опухоли [10].

Для изучения патоморфоза опухоли применяли морфологические и морфометрические методы, использовали окраску гистологических срезов гематоксилином и эозином. При иммуногистохимическом исследовании применяли систему детекции REVEAL Polyvalent HRP-DAB Detection System с антителами ABCAM в разведении к антителу от 1:50 до 1:100. Использовали следующую панель моно- и поликлональных антител: маркеры апоптоза (p53 (clone PAb 1801, ab28), bax (clone 100/D5, ab692), bcl-2 (ab54829), Fas-receptor (ab15285), Fas-ligand (ab82419)) для установки возможного пути его реализации, аутофагии LС3b (ab48394) для уточнения роли этого процесса в механизме гибели клеток опухоли, маркер пролиферации Ki-67 (clone SP6, ab16667) и ангиогенеза VEGF (clone JH121, ab28775). При окраске с иммуногистохимическими маркерами использовали положительный и отрицательный контроль для исключения ложноотрицательных и ложноположительных результатов, окрашивание на каждый маркер проводили для всех образцов тканей единовременно для создания стандартизации условий окраски и повышения объективности полученных результатов. Подсчитывали процент экспрессирующих клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, а также степень выраженности иммуногистохимических реакций (слабая, умеренная и выраженная). Учитывали наличие дистрофических и некротических изменений и также такие цитоморфометрические показатели, как диаметр опухолевых клеток, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения. Все морфометрические исследования проводили с помощью микровизора медицинского проходящего света µVizo-103 (ЛОМО) при увеличении 774.

При статистической обработке данных нормальность распределения показателей в группах проверяли при помощи критерия Шапиро—Уилка. Для сравнения средних полученных показателей использовали критерий Крамера—Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе разность средних с вероятностью в 95% определяется при Т≥1,96 и p<0,05. Весь статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения Statistiсa 10.0 Interprise.

В группе сравнения перевитый рак почки макроскопически был представлен опухолью, состоящей из одного или несколько узлов, масса опухоли составила 11,52±2,34 г. При введении экстракта аврана наблюдали резкое замедление темпов роста опухоли, в конце эксперимента в опытной группе с внутримышечным введением опухоль была меньше на 73% (3,1±1,1 г), чем в группе сравнения, а при пероральном введении — на 71% (3,29±1,2 г). Макроскопически опухоль после курса введения экстракта была представлена одним узлом, имеющим на разрезе пестрый вид.

При гистологическом исследовании в ткани опухоли на 12-й день эксперимента обнаруживались обширные зоны некроза и дистрофические изменения опухолевых клеток, а также визуализировались апоптотические тельца. Митозы не встречались в отличие от группы сравнения (без лечения), где фигур митозов насчитывали до 2 в поле зрения. По данным морфометрического исследования выявлено статистически значимое снижение среднего числа клеток в поле зрения в 2 раза при внутримышечном введении экстракта аврана и 1,6 раза при пероральном введении (табл. 1).

При иммуногистохимическом исследовании ткани рака с маркером Ki-67 в группе сравнения индекс пролиферации составил 48%, причем у большей части иммунопозитивных ядер клеток экспрессия была выраженной. В экспериментальных группах при обоих путях введения экстракта аврана экспрессия Ki-67 не выявлялась (индекс пролиферации был равен 0) (см. табл. 1).

При иммуногистохимической реакции ткани рака почки РА с использованием маркера ангиогенеза VEGF в группе сравнения наблюдали слабую цитоплазматическую экспрессию в клетках опухоли. В экспериментальных группах как с внутримышечным, так и с пероральным введением экстракта аврана экспрессия маркера ангиогенеза VEGF отсутствовала (табл. 2, рис.

В группе сравнения при окраске на маркер апоптоза р53 выявили отсутствие экспрессии. После введения экстракта аврана в опытных группах в опухолевой ткани отмечали появление умеренной как цитоплазматической, так и ядерной экспрессии маркера апоптоза p53. Обращало на себя внимание, что маркер экспрессировался в апоптотических тельцах и в клетках без ядер. При внутримышечном введении экстракта процент клеток с положительной экспрессией достигал 60,5, а при пероральном пути введения — 37,5 (см. табл. 2, см. рис. 1).

При иммуногистохимическом выявлении цитоплазматического маркера активации апоптоза Bax в клетках рака почки РА группы сравнения наблюдали отрицательную реакцию, так же как и в группе с пероральным путем введения экстракта аврана. При внутримышечном введении экстракта аврана отмечали умеренную экспрессию маркера в 58,2±12,8% клеток (см. табл. 2, см. рис. 1). Кроме того, экспрессия Bax при внутримышечном введении отмечалась в клетках с конденсированным ядром, в безъядерных клетках и апоптозных тельцах, это может быть подтверждением того, что опухолевые клетки при воздействии экстракта погибают главным образом по механизму апоптоза.

Однако при оценке экспрессии иммуногистохимического маркера блокатора апоптоза Bcl-2 наблюдали отрицательную окраску как в группе сравнения, так и после курсового введения экстракта аврана, что мы связываем с биологическими особенностями перевитого рака почки РА.

При иммуногистохимическом окрашивании маркером клеточной смерти CD95 (Fas/APO-1) в клетках рака почки РА в группе сравнения отмечали отрицательную реакцию. Введение экстракта аврана вызывало выраженную цитоплазматическую экспрессию данного рецептора в клетках рака почки РА при внутримышечном введении в 83,1% и при пероральном в 24,6% (см. табл. 2, рис. 2).

В группе сравнения при окраске ткани рака почки РА маркером FAS-ligand отмечали отрицательную реакцию. При введении экстракта аврана наблюдали слабую мембранную и цитоплазматическую экспрессию FAS-ligand: при внутримышечном введении до 38,4% клеток и при пероральном до 49% клеток (cм. табл. 2, см. рис. 2).

При иммуногистохимическом окрашивании на маркер аутофагии LC3b в клетках рака почки РА группы сравнения отмечали зональную слабую положительную экспрессию в 7,8% клеток. При пероральном пути введения наблюдали умеренную очаговую экспрессию маркера LC3b и увеличение числа экспрессировавших его клеток до 12,3%. Следует отметить, что при этом экспрессия проявлялась в виде многочисленной мелкой зернистости. По мнению ряда авторов, такое окрашивание свидетельствует о запуске аутофагии [11]. Это обусловлено тем, что LC3b фиксируется на поверхности аутофагосом и клетка за счет этого приобретает пятнистый вид. При внутримышечном введении экстракта аврана наблюдали цитоплазматическую экспрессию LC3b в единичных клетках (1,2±0,8%) (см. табл. 2, см. рис. 2).

Иммуногистохимическое исследование позволило выявить некоторые механизмы, лежащие в основе клеточной гибели опухолевых клеток при воздействии экстракта аврана в раке почки Р.А. Установлено, что в результате действия экстракта значительно снижается пролиферативная активность в клетках рака почки. Блокирование деления клеток опухоли лежит в основе действия большинства цитостатических препаратов, однако они блокируют деление клетки на фазе митоза [1].

Исследование показало, что под действием экстракта происходит переход опухолевых клеток в G0-фазу. Кроме того, снижается экспрессия маркера ангиогенеза и происходит активация всех путей апоптоза: митохондриального через белки p53, BAX и внешнего рецепторного через белки CD95 (Fas/APO-1) и FAS-ligand. Все описанные процессы развиваются в 1,5—2 раза интенсивнее при внутримышечном пути введения аврана.

Данные, полученные с помощью иммуногистохимии, согласуются и с гистологическими изменениями в ткани опухоли: отсутствие митозов, уменьшение размеров ядра и клетки, снижение количества клеток в поле зрения. Установлено, что, несмотря на выраженные изменения в ткани опухоли, у животных отсутствовали признаки интоксикации, сопровождающие, как правило, некротические процессы, и это подтверждает полученные данные о том, что опухолевые клетки погибают за счет активации апоптоза.

До настоящего времени в литературе нет однозначного мнения о значении развития аутофагии в опухолевых клетках. Так, некоторые авторы отмечают более благоприятный прогноз у пациентов при появлении аутофагосом в опухолевых клетках [12], но большинство исследователей считают, что экспрессия LC3b связана с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [13—15]. Мнения всех авторов сходятся в том, что аутофагия может развиваться в опухолевых клетках как защитный механизм опухолевой клетки при лечении [12—16], с чем мы полностью согласны. Установлено, что частота развития цитопротекторной аутофагии зависит от пути введения. Так, при внутримышечном введении аврана частота развития аутофагии в опухолевых клетках была в 10 раз меньше, чем при пероральном, по-видимому, из-за большей биодоступности. Следует заметить, что в группе животных после перорального введения экстракта аврана количество опухолевых клеток с аутофагосомами стало больше, чем в группе сравнения. Этот факт свидетельствует о том, что аутофагия действительно развивается как защитный механизм опухолевой клетки при действии повреждающего агента, которым является в данном случае экстракт с противоопухолевым действием, и лежит в основе возникновения резистентности опухоли к противоопухолевой терапии.

Поэтому нельзя исключить, что появление факта аутофагии может считаться признаком развития резистентности опухоли к действию препаратов из-за недостаточной дозировки, и это необходимо учитывать при оценке степени патоморфоза и определении дальнейшей тактики лечения пациентов.

1. Выраженный патоморфоз рака почки (2—3-й степени) происходит после введения экстракта аврана и проявляется развитием выраженных некротических и атрофических изменений в опухолевых клетках (уменьшение размеров ядра и клетки в 1,5 раза), снижением пролиферативной активности, исчезновением митозов, запуском апоптоза митохондриальным и рецепторным путем.

2. Установлено, что недостаточная концентрация экстракта аврана в опухолевых клетках, обусловленная пероральным путем его введения, способствует развитию цитопротекторной аутофагии. При внутримышечном введении экстракта, позволяющем повысить концентрацию экстракта в опухолевой ткани, процесс развития цитопротекторной аутофагии блокируется. Полученные результаты позволяют предположить, что маркер аутофагии LC3b может использоваться в качестве дополнительного критерия оценки лечебного патоморфоза опухолей, так как отражает эффективность проводимой терапии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18−015−00298. Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России «Исследование экстрактов лекарственных растений, содержащих флавоноиды и их фракции, с целью создания препаратов, обладающих противоопухолевой, антиоксидантной, антикахексической и другой активностью».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г. Н.М., Н.В.П., Н.А.Н.

Сбор и обработка материала — Д.А.М., Н.А.Н.

Статистическая обработка — Д.А.М., Н.А.Н.

Написание текста — Н.А.Н.

Редактирование — Г. Н.М., А.Б.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Наволокин Никита Александрович — e-mail: nik-navolokin@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7876-9758

Маслякова Галина Никифоровна — e-mail: gmaslyakova@yandex.ru;
https://orcid.org/0000-0001-8834-1536

Полуконова Наталья Владимировна — https://orcid.org/0000-0001-9228-6808

Мудрак Дмитрий Андреевич — https://orcid.org/0000-0001-7399-9204

Бучарская Алла Борисовна — https://orcid.org/0000-0003-0503-6486