Введение

Диагностика и лечение сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса (ХСНсФВ) представляют собой одну из самых сложных задач современной кардиологии [1, 2]. В связи с растущей распространенностью этого заболевания поиск новых молекулярных мишеней и разработка современных подходов к лечению не теряет своей актуальности. В последние годы появились работы, подтверждающие важную роль аутофагии в развитии сердечной недостаточности (ХСН) и ряда других кардиологических заболеваний [3]. Аутофагия — эволюционно-консервативный механизм, способствующий поддержанию клеточного гомеостаза путем утилизации макромолекул и органелл через лизосомальный путь деградации [4, 5]. В сердце аутофагия поддерживается на базальном уровне, но ее уровень может быть существенно повышен при воздействии стрессовых факторов, таких как гипоксия, стресс эндоплазматического ретикулума, окислительный стресс и пр., что обеспечивает кардиопротективное воздействие при возникновении ишемии, чрезмерной β-адренергической стимуляции и голодании [6—9]. В работе G. Takemura на модели постинфарктной сердечной недостаточности было убедительно показано, что активация аутофагии уменьшает размер инфаркта и проявления сердечной дисфункции, что указывает на защитную роль аутофагии [10]. Несмотря на то что аутофагия в целом является кардиопротекторной, ее чрезмерная активация может усугубить течение ХСН. Например, делеция лимфоцитарного антигена 86 гиперактивирует аутофагию, запуская сигнальный каскад ROS-MAPK, что приводит к прогрессированию ХСНсФВ [11]. Таким образом, аутофагия может выступать в роли разнонаправленного регулятора сердечного гомеостаза, обеспечивая как выживание, так и гибель клеток сердечного микроокружения. При этом в большинстве проведенных исследований оценку аутофагии проводят на «макроуровне» (на целом сердце) и не учитывают специализированный ответ отдельных популяций клеток, что не позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов работы этой системы. В рамках данного исследования мы впервые сосредоточились на исследовании аутофагии в фибробластах сердца, которые являются важнейшими участниками развития фиброза и диастолической дисфункции, характерных для ХСНсФВ независимо от причин ее возникновения. Несмотря на актуальность этого направления, научные данные об участии аутофагии в механизмах регуляции сердечных фибробластов и развитии сердечного фиброза остаются весьма ограниченными.

Цель работы — провести исследование активности аутофагии в фибробластах сердца на ранних этапах развития сердечной дисфункции, вызванной перегрузкой сердца давлением.

Материал и методы

Животные

Все манипуляции с животными были одобрены Этическим комитетом института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии им. акад. Е.И. Чазова» (разрешение № LA/28.07.2023 (от 28 июля 2023 года) и № LA/26.09.2023 (от 28 сентября 2023 года) и проводились с учетом действующих международных норм. Все исследования осуществлялись на мышах-самцах C57BL/6J массой 20—23 г. На протяжении всех экспериментов мышей содержали при температуре 24 °C с 12-часовым циклом день—ночь с обеспечением свободного доступа к пище и воде. Эвтаназию животных проводили путем наркотизации Изофлураном и последующей дислокации шейного отдела позвоночника.

Моделирование поперечного сужения аорты

Животные были разделены на две группы: 1 группа — ложнооперированные животные (n=20); 2 группа — животные с моделированием поперечного сужения аорты (ПСА) (n=20). Для моделирования ПСА обеспечивали доступ в грудную полость через верхнюю срединную стернотомию. В операционном поле проводили дислокацию тимуса, мышц шеи для формирования доступа к дуге аорты и заводили шовную нить 6,0 под аортой между местами отхождения брахиоцефальной и левой общей сонной артерий. Затем изогнутая игла 27G размещалась на дуге аорты, поверх которой завязывали лигатуру. После затягивания лигатуры (вокруг иглы и аорты) иглу быстро удаляли. Контрольным мышам выполняли идентичную процедуру без наложения лигатуры на дугу аорты (ложнооперированные животные). После проведения манипуляции проводили послойное ушивание раны. Эвтаназию животных проводили через 14 дней после манипуляции.

Проведение биоинформатических исследований

Использовали находящиеся в свободном доступе данные секвенирования единичных клеток (код доступа GSE166403, [12]), выделенных из сердец мышей на ранней стадии развития сердечной недостаточности (14 дней после поперечного сужения аорты). У использованных авторами мышей под промоторы основных генов-маркеров фибробластов (Col1a1, Gli1, Pdgfrb) был помещен ген, кодирующий флуоресцентный белок tdTomato, позволяющий идентифицировать клетки как методом клеточного сортинга, так и биоинформатически [12].

Биоинформатическая обработка и анализ данных выполнялись на языке R v.4.3.2 по модифицированному протоколу [12]. В первую очередь данные подвергались фильтрации от пустых капель, дублетов, низкого числа уникальных молекулярных идентификаторов UMI (<500) и генов на клетку (<500), загрязнения митохондриальными РНК (>10%) (апоптотические клетки) с использованием пакетов Seurat v5.0.1 (Assay v3), DropletUtils v1.22.0, scDblFinder v1.16.0, SingleCellExperiment v1.24.0. После нормализации данных пакетом SCTransform v.0.4.1 и уменьшения размерности (число измерений 20) образцы были интегрированы с использованием функции IntegrateData пакета Seurat, после чего данные нормализовали и шкалировали. Клетки, не экспрессирующие tdTomato, были удалены. Снижение размерности было выполнено функцией RunPCA пакета Seurat на основе 50 принципиальных компонент. Кластеризация была выполнена с использованием функций FindNeighbors (число измерений 1:20) и FindClusters (разрешение 0,3) пакета Seurat, затем кластеры, которые обладали низким качеством или формировали кластеры муральных клеток, удаляли. Кластеры визуализировали при уменьшении размерности и проекции с использованием алгоритма UMAP. Отдельные популяции фибробластов выделили по уровню экспрессии избранного гена (Thy1, Ddr2, Tcf21, Postn, S100a4 или Wt1)>0,3. Дифференциальную экспрессию оценивали функцией FindMarkers пакета Seurat с применением теста Вилкоксона (порог логарифма экспрессии =0,1, т.е. в численном варианте в 1,08 раза).

Анализ криосрезов сердца после моделирования ПСА

Для проведения гистологических исследований сердца мышей извлекали, промывали физиологическим раствором, заключали в среду Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek, Япония), замораживали в парах жидкого азота и использовали для подготовки криосрезов. Изготавливали криосрезы толщиной 7 мкм на криостате Leica CM1900 (Германия), помещали на предметные стекла и хранили при –70˚C.

Окрашивание срезов сердец пикросириусом красным (Picrosirius red) для визуализации коллагенов проводили в соответствии с ранее описанными протоколами [13—15]. Срезы промывали дистиллированной водой и помещали в горячий раствор красителя на 60 мин. Затем срезы промывали 3 раза 5% раствором уксусной кислоты. После окрашивания слайды промывали дистиллированной водой, обезвоживали и монтировали, используя среду на основе ксилола. Окрашенные препараты исследовали с помощью стандартной световой и поляризационной микроскопии, документирование изображений выполняли с помощью прибора Leica Aperio CS2 (Leica, Германия). Детекцию кардиомиоцитов и анализ уровня гипертрофии проводили с использованием криосрезов, окрашенных антителами к ламинину (Abcam, США). Морфометрический анализ проводили путем измерения размеров кардиомиоцитов с помощью программы Image J (National Institutes of Health, США).

Оценка экспрессии белков-регуляторов аутофагии методом иммуноблоттинга

Для получения образцов для анализа уровня аутофагии использовали образцы сердечной ткани левого желудочка контрольных животных и мышей после моделирования ПСА. Для получения лизатов образцы ткани сердца гомогенизировали в жидком азоте в присутствии RIPA-буфера (1% NP40, 150 мM NaCl, 0,1% SDS, 50 мM Трис-HCl), содержащего ингибиторы протеаз и фосфатаз (Servicebio, Китай), инкубировали 60 минт при +4°C, а затем центрифугировали 14 000 g 2 раза. Белки лизатов разделяли методом ДСН-электрофореза в 10% полиакриламидном геле на приборе Mini-PROTEAN 2 (Bio-rad, США). Электроперенос осуществляли на ПВДФ-мембрану (Millipore, США) на приборе Trans-blot Turbo (Bio-rad, США). После электропереноса мембрану инкубировали в блокирующем буфере (фосфатно-солевой буфер, содержащий 5% сухое обезжиренное молоко) (AppliChem, США). Далее мембраны инкубировали антителами против LC3 I/II (Abclonal, США) и Gapdh (Cell signaling, США) в течение 12 ч, +4°C при постоянном перемешивании. Затем мембраны отмывали 3 раза в ФСБ, содержащем 0,05% Tween-20 (каждая отмывка по 10 минут при постоянном перемешивании). После промывок мембраны инкубировали с вторичными антителами против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена AffiniPure (H+L) (Jackson ImmunoResearch, США). Затем мембраны отмывали 3 раза по 10 минут каждый в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% Tween-20. Детекцию белков LC3 I/II, различающихся по массе (около 14/15 кДа), осуществляли с помощью хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, США). Сигнал фиксировали с помощью гель-документирующей системы Fusion-SL 3500,WL (Vilber Lourmat, Франция). Морфометрический анализ проводили в программе Image J (National Institutes of Health, США).

Микроскопия и анализ изображений

Анализ клеток и криосрезов миокарда проводили с использованием флюоресцентного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss, США) и программного обеспечения AxioVision 4.8 (Carl Zeiss, США).

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (М±SD). Статистический анализ данных проводили с помощью программ Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., США) и GraphPad Prism (GraphPad Software 8.3.0, США). Сравнение между группами проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. Различия считались статистически значимыми при значениях p<0,05.

Результаты

Для исследования участия аутофагии в развитии сердечного фиброза мы использовали модель поперечного сужения аорты, вызывающую перегрузку сердца давлением (рис. 1, а). Мы обнаружили, что через 2 недели после проведения операции у животных наблюдается развитие признаков гипертрофии ЛЖ, что подтверждает эффективность проведения хирургической манипуляции (см. рис. 1, г). После чего мы исследовали уровень фиброза на основе морфометрической оценки окрашиваний срезов пикросириусом красным. Было обнаружено, что увеличение постнагрузки сопровождалось развитием периваскулярного фиброза, чего не наблюдалось у животных контрольной группы (см. рис. 1, б, в). Несмотря на наблюдающуюся тенденцию к накоплению коллагенов в интерстиции после операции ПСА мы не обнаружили достоверных различий между группами, что может быть объяснено коротким периодом наблюдения (см. рис. 1, д). В сердцах животных после проведения ПСА мы выявили снижение соотношения LC3II/LC3 I, что указывает на уменьшение активности аутофагии в гетерогенной популяции клеток сердца (см. рис. 1, е).

Рис. 1. Параметры ремоделирования и уровня аутофагии в сердцах ложнооперированных мышей (ЛО) и после поперечного сужения аорты (ПСА).

а — схематическое изображение зоны перевязки аорты для моделирования перегрузки сердца давлением; б, в — репрезентативные изображения срезов сердец ложнооперированных мышей (б) и после поперечного сужения аорты (в), окрашенных пикросириусом красным; г — график оценки уровня гипертрофии в ЛО и ПСА сердцах; д — график оценки распространенности фиброза в ЛО и ПСА сердцах; е — график оценки аутофагии по уровню LC3II/LC3I в ЛО и ПСА сердцах. Масштабный отрезок — 200 мкм.

Для детального исследования аутофагии в фибробластах сердца мы использовали данные транскриптома единичных клеток сердца, экспрессирующих флуоресцентный белок tdTomato, который был встроен под промоторы генов Col1a1, Pdfrb и Gli1 (рис. 2). Исследуемые клетки формировали гетерогенную популяцию фибробластов, которая характеризовалась экспрессией декорина (Dcn, 100%), коллагена I (Col1a1, 98,7%), рецептора тромбоцитарного фактора роста альфа (Pdgfra, 83,4%), а также тирозинкиназного рецептора Ddr2 (46,9%) (см. рис. 2, г). Мы обнаружили, что моделирование ПСА не вызывало перераспределения фибробластов и не приводило к образованию новых субпопуляций (см. рис. 2, в). На основании результатов кластеризации и анализа дифференциальной экспрессии генов в общем пуле фибробластов были выделены 6 популяций, которые различались по функциональности (см. рис. 1, а, б): фибробласты, отвечающие за реализацию стрессового ответа (Atf3, Cxcl1, Fosb, Fos, Jun), пролиферирующие (Htra1, Fap, Smoc2, Sept4, Cxcl14), синтетические (Postn, Cilp, Ltbp2, Ctgf, Col8a1), адгезивные (Efhd1, Sema3c, Cd248, Cd55, Jpt1), регуляторные (Wisp2, Sfrp2, Ptn, Adm, Fgl2) фибробласты, а также фибробласты, в которых активен ответ на интерферон (Ifit3, Ifit1, Ifit3b, Rsad2, Ifi47). Через 14 дней после ПСА увеличивалась доля синтетически активных фибробластов, характеризующихся повышенной экспрессией генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса, а также фибробластов, в которых была активна экспрессия генов, участвующих в ответе на интерферон (см. рис. 2, д). Исследуемые фибробласты характеризовались экспрессией генов, участвующих в аутофагии, в особенности Sqstm1, а также Atg3, Atg5 и в меньшей степени Atg7, Becn1 и Ulk1, уровень экспрессии которых существенно не изменялся в фибробластах сердца после увеличения постнагрузки (см. рис. 2, е). При этом после ПСА увеличивалась доля фибробластов, экспрессирующих гены аутофагии, более всего Atg5 (на 9%) (см. рис. 2, е).

Рис. 2. Биоинформатический анализ данных транскриптома единичных фибробластов сердца, выделенных из сердец мышей ложнооперированных (Ложн) и после поперечного сужения аорты (ПСА).

а — точечный график 5 маркерных генов для каждого кластера фибробластов, уровень экспрессии генов представлен в виде теплового градиента, доля клеток, экспрессирующих данный ген, отражена размером точки; б — кластеризация фибробластов в координатах UMAP; в — проекция фибробластов, выделенных из сердец мышей ложнооперированных и после поперечного сужения аорты в координатах UMAP; г — UMAP-визуализация относительного уровня экспрессии генов-маркеров фибробластов Dcn, Col1a1, Pdgfra и Ddr2; д — столбчатая диаграмма, отражающая долю фибробластов в зависимости от формируемого кластера; е — точечный график экспрессии генов аутофагии в общей популяции фибробластов.

Далее мы исследовали отдельные субпопуляции сердечных фибробластов (Thy1, Ddr2, Tcf21, Postn, S100a4), участвующие в патогенезе сердечной недостаточности (рис. 3). Thy1+ фибробласты преимущественно относились к кластеру адгезивных фибробластов, Postn+ фибробласты — к кластеру синтетически активных фибробластов, S100a4+ — к кластерам синтетических и адгезивных фибробластов, Ddr2+ и Tcf21+ фибробласты были распределены равномерно по всем шести кластерам (см. рис. 3, а). Биоинформатический анализ данных показал, что экспрессия генов Atg3, Atg7, Sqstm1, Becn1, Ulk1 существенно не изменяется в Thy1+, Ddr2+, Tcf21+, Postn+, S100a4+ фибробластах, полученных из сердец животных контрольной группы и после моделирования ПСА (см. рис. 2, б). При этом также, как и в общем пуле фибробластов, наблюдалось увеличение доли клеток, экспрессирующих Atg5.

Рис. 3. Экспрессия генов аутофагии в отдельных субпопуляциях фибробластов.

а — график-скрипка, отражающий относительный уровень экспрессии генов Thy1, Ddr2, Tcf21, Postn и S100a4 в различных кластерах фибробластов. Красной пунктирной линией обозначено пороговое значение экспрессии гена, выше которого фибробласты считались позитивными; б — точечный график экспрессии генов аутофагии в Thy1+, Ddr2+, Tcf21+, Postn+, S100a4+ субпопуляциях фибробластах, выделенных из сердец мышей ложнооперированных (Ложн) и после поперечного сужения аорты (ПСА). Уровень экспрессии генов представлен в виде теплового градиента, доля клеток, экспрессирующих данный ген, отражена размером точки.

Таким образом, результаты исследования транскриптома фибробластов сердца не выявили статистически значимых изменений уровня экспрессии генов, ассоциированных с аутофагией, на ранних сроках после моделирования сердечной недостаточности. При этом перегрузка сердца давлением вызывала увеличение доли клеток, экспрессирующих Atg5 как в общем пуле фибробластов сердца, так и в отдельных его субпопуляциях (Thy1+, Ddr2+, Tcf21+, Postn+, S100a4+).

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что перевязка дуги аорты способствует развитию перегрузки сердца давлением, сопровождающейся развитием гипертрофии кардиомиоцитов, периваскулярного фиброза и начальными признаками накопления коллагенов в интерстиции. Эти морфологические изменения сопровождались снижением уровня активности аутофагии в сердечной ткани. Детальные биоинформатические исследования транскриптома единичных клеток позволили выяснить, что на ранних этапах развития сердечной дисфункции не наблюдалось изменение экспрессии генов, ассоциированных с аутофагией, в тотальном пуле сердечных фибробластов и отдельных его субпопопуляциях.

Хорошо известно, что перестройка структуры сердца после поперечного сужения аорты сопровождается развитием гипертрофии кардиомиоцитов, активацией перехода фибробластов в миофибробласты и усилением синтеза коллагенов, что требует активации синтеза белка и переключения энергетического обмена в направлении анаболических процессов. В нашем исследовании мы обнаружили, что ремоделирование сердца характеризовалось признаками подавления аутофагии. Эти данные совпадают с результатами других исследовательских групп, описывающих подавление катаболических процессов на ранних стадиях развития сердечной дисфункции. Например, в краткосрочном исследовании Pfeifer et al. [16] 10-минутная инфузия β-адренергического агониста изопротеренола в сердце крысы уменьшила содержание аутофагических вакуолей в клетках на 50%. Аналогично в другой модели перегрузки давлением аутофагия подавлялась через 1 неделю после ПСА [17]. Вероятно, изменение активности аутофагии может отвечать за адаптацию сердечной мышцы к новым условиям функционирования, что может быть реализовано посредством регуляции гипертрофии кардиомиоцитов. Действительно, при старении [18], использовании высокожировой диеты [19, 20], гиперэкспрессии miR-221 [21] наблюдается стойкое подавление аутофагии, что ведет к усилению гипертрофического ответа кардиомиоцитов. При этом использование рапамицина, соединения-активатора аутофагии, предотвращало развитие патологических изменений и способствовало уменьшению сердечного ремоделирования и гипертрофии кардиомиоцитов [18]. Кроме того, при болезни Данона, характеризующейся генетически наследуемым дефицитом лизосомно-ассоциированного мембранного белка-2 (LAMP-2) и нарушением аутофагии, наблюдается развитие тяжелой гипертрофической кардиомиопатии [22, 23]. Вместе с тем следует учитывать, что уровень снижения аутофагии принципиально важен для развития патологических реакций.

В работе группы профессора Хилла было показано, что частичное подавление аутофагической активности у Beclin 1+/– животных замедляет вызванное нагрузкой патологическое ремоделирование левого желудочка, а гиперэкспрессия Beclin 1, вызывающая увеличение аутофагии, усиливала проявления патологических изменений [24]. Эти данные указывают на важность и необходимость точного определения изменений уровня активности аутофагии в каждом типе клеток сердца для детального изучения патогенетических механизмов развития сердечной дисфункции. В сердце помимо кардиомиоцитов содержится большое количество других типов клеток, которые могут демонстрировать разный ответ на гемодинамическое воздействие. Детекция уровня аутофагии в разных клеточных линиях сердца in vivo является сложной задачей, которая не может быть решена стандартными инструментальными подходами. В связи с этим для оценки уровня аутофагии был использован метод оценки транскриптома единичных клеток, которые открывают новые возможности для исследования патогенеза заболеваний сердца. В нашей работе мы сосредоточились на оценке уровня аутофагии в разных популяциях фибробластов (Thy1+, Ddr2+, Tcf21+, Postn+, S100a4+), которые являются важнейшими регуляторами развития фиброза в сердце [25, 26]. Мы обнаружили, что моделирование сердечной недостаточности у мышей сопровождается увеличением числа синтетически активных фибробластов, а также клеток, отвечающих на воздействие интерферонов, что косвенно указывает на активацию пула фибробластов сердца и активизацию их взаимодействия с клетками иммунной системы [27].

Детальное исследование генов, ассоциированных с аутофагией (Atg3, Atg7, Sqstm1, Becn1, Ulk1) показало, что их уровень существенно не изменяется в тотальной популяции фибробластов и отдельных ее субпопуляциях (Thy1+, Ddr2+, Tcf21+, Postn+, S100a4+) в сравнении с ложнооперированными животными. При этом наблюдалось увеличение числа клеток, экспрессирующих ген Atg5, что может быть обусловлено его участием в механизмах клеточной гибели путем апоптоза [28] или других процессах [29]. Интересно, что уровень активности аутофагии может оказывать регуляторное воздействие на процесс трансформации фибробластов в направлении миофибробластов. Так, в работе Гупта было показано, что подавление аутофагии препятствует трансформации кардиальных фибробластов в миофибробласты, о чем свидетельствовало уменьшение экспрессии αSMA и ED-A фибронектина, а также снижение их сократительной и миграционной активности [30]. Можно предположить, что на ранних стадиях патологического процесса отсутствие изменений уровня аутофагии может тормозить запуск адаптивных механизмов, препятствующих избыточному образованию миофибробластов, отложению коллагенов, что согласуется с результатами гистологических исследований. Между тем перегрузка сердца давлением сопровождалась развитием периваскулярного фиброза, что также может иметь отношение к регуляции клеток сосудистого микроокружения за счет аутофагии. В работах исследователей из Института молекулярной медицины Джефферсона было показано, что аутофагия задействована в образовании пула фибробластов путем трансформации клеток сосудистой стенки [31]. Было показано, что активность аутофагии важна для поддержания фенотипа эндотелиальных клеток, а ее подавление способствует появлению признаков эндотелильно-мезенхимального перехода и профиброзной трансформации клеток эндотелия [31, 32], что может вносить вклад в развитие периваскулярного фиброза.

Таким образом, перегрузка сердца давлением сопровождалась признаками ремоделирования сердца и снижением тотального уровня аутофагии в ткани. Фибробласты демонстрировали различия в специализированном ответе на перегрузку сердца давлением в сравнении с тотальным пулом клеток миокарда. Отсутствие изменений профиля экспрессии генов, ассоциированных с аутофагией, в фибробластах может свидетельствовать в пользу подавления механизма адаптации сердечных фибробластов к новым условиям функционирования. Использование аутофагии в качестве индикатора прогрессирования сердечного фиброза требует подтверждения и проведения дополнительных исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 23-15-00540.

Равноценный вклад авторов в подготовку и написание статьи — К.В. Дергилев, Ю.Д. Гольцева