Исследование численных нарушений генов при раке молочной железы методом мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов

Рак молочной железы (РМЖ) - очень неоднородное заболевание, внутри которого можно выделить несколько типов. В 2000 г. была предложена молекулярная классификация РМЖ [2]. В ходе малигнизации и онкогенеза происходят сложные множественные нарушения генома. Их выявление позволяет определить подтип опухоли, прогноз течения заболевания и ответ на терапию. Ни один из генов сам по себе не может быть идеальным диагностическим маркером. Поэтому актуальным становится необходимость генетического теста, позволяющего исследовать одновременно несколько (десятки) генов. Одной из таких методик является мультиплексная лигазозависимая амплификация зондов - MLPA (от англ. multiplex ligation-dependent probe amplification). В настоящем исследовании мы приводим свой опыт по тестированию образцов РМЖ с помощью MLPA-анализа.

Материалом для исследования послужили 65 образцов опухолей в парафиновых блоках с установленным гистологическим диагнозом РМЖ. В качестве контроля использовали парафиновые блоки с образцами нормальной молочной железы. После верификации опухоли на окрашенном гематоксилином и эозином препарате идентифицировали соответствующие регионы на серийных неокрашенных срезах, затем при помощи скальпеля проводили микродиссекцию опухолевых клеток в пробирку (1,5 мл) типа «эппендорф». Выделение ДНК проводили с использованием набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit («Qiagen») согласно инструкции производителя. Для MLPA-анализа использовали набор SALSA MLPA KIT P078-B1 Breast Tumour («MRC-Holland»). Данная тест-система позволяет проводить одновременный анализ численных генетических нарушений в следующих генах: ERBB2, MYC, TRAF4, C11orf30 (EMSY), ADAM9, IKBKB, CCNE1, TOP2A, CDH1, CDC6, ESR1, CPD, EGFR, MTDH, CCND1, BIRC5, MED1, FGFR1, MAPT, PRDM14, AURKA. Детекцию результатов проводили на приборе 3130-Genetic Analyzer («Applied Biosystems»). Количественный анализ результатов выполняли с применением программы Coffalyser («MRC-Holland»). Ввиду того что MLPA является относительно новой методикой генетического анализа, рассмотрим кратко принцип данного метода. Весь MLPA-анализ можно условно разделить на 5 основных этапов: денатурация и гибридизация, лигазная реакция, ПЦР-амплификация гибридизовавшихся ДНК-зондов, электрофоретическая детекция результатов, количественный анализ данных.

1. Выделенная ДНК подвергается денатурации и гибридизации со специфичными для исследуемых генов олигонуклеотидными зондами. Каждый зонд состоит из двух частей, которые гибридизуются на таргетной ДНК таким образом, что между ними остается «пробел» в один нуклеотид. Каждая из двух частей зонда содержит последовательность, комплементарную одному из пары универсальных праймеров. Для наиболее значимых генов тест-система содержит несколько зондов, комплементарных разным участкам этого гена. Так, например, используемый нами тест-набор содержит 4 зонда к гену ERBB2 (HER2). Это позволяет значительно увеличить надежность получаемых результатов. Все перечисленные реакции протекают в стандартной ПЦР-пробирке, находящейся в термоциклере.

2. После 16-20 ч гибридизации в реакцию добавляют фермент - лигазу, которая «сшивает» две половины каждого зонда между собой. Данная реакция увеличивает специфичность теста, поскольку лигазная реакция может пройти только в том случае, когда две половины зонда гибридизовались строго специфично и находятся рядом.

3. Затем в реакцию вносят ПЦР-смесь, содержащую пару универсальных праймеров, меченных флюоресцентным красителем. Происходит экспоненциальное накопление меченых ПЦР-продуктов, которые являются копиями имеющихся в реакции лигированных зондов, т.е. в ПЦР участвует не выделенная (исследуемая) ДНК, а гибридизовавшиеся на ней зонды. Количество ПЦР-продуктов зависит от числа гибридизовавшихся на анализируемой ДНК зондов, а значит и числа исследуемых генов в данном образце. ПЦР возможна только при успешной гибридизации обеих половин зонда и их лигировании, поскольку только в этом случае на концах лигированного зонда находятся участки, комплементарные универсальным праймерам. Если лигазная реакция не прошла, то имеется участок комплементарный только одному из праймеров. Такой зонд не может быть экспоненциально амплифицирован в ходе ПЦР и поэтому дать флюоресцентный сигнал.

4. По завершении ПЦР проводится детекция результатов при помощи капиллярного электрофореза.

В ПЦР участвовала только одна пара праймеров. Различие ПЦР-продукта, специфичного для одного гена, от другого основано на их разной длине. Это обеспечено производителем тест-системы путем введения уникальной по длине «вставки» - последовательности ДНК, которую внедрили в зонды между его специфичной для гена последовательностью и последовательностью, комплементарной одному из праймеров. Ввиду разной длины вставки для разных генов получаемые ПЦР-продукты разнятся по длине и легко разделяются при электрофорезе.

5. На заключительном этапе происходит количественный анализ флюоресценции пиков. Интенсивность флюоресценции исследуемых генов сравнивается с интенсивностью «референсных» генов (гены, которые при РМЖ не подвергаются количественным нарушениям). Вычисляя отношение интенсивностей флюоресценции - исследуемый ген/референсный ген - делается вывод о наличии/отсутствии численных нарушений (амплификации/делеции) анализируемых генов в исследуемом образце опухоли.

Подробную информацию о принципе метода и сути количественного анализа получаемых результатов можно узнать на сайте www.mlpa.com.

MLPA-анализ успешно проведен во всех исследуемых образцах. Полученные генетические профили наглядны и уникальны для каждого пациента (см. рисунок).

Таким образом, MLPA-исследование - удобный и перспективный метод мультиплексного генетического анализа опухолевых клеток при раке молочной железы.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.Э.З., А.Э.М.

Сбор и обработка материала: Л.Э.З., А.Э.М., А.В.П.

Статистическая обработка данных: М.З.Г.

Написание текста: А.В.П.

Редактирование: М.З.Г.