Экспрессия каспазы-3 в тканях экспериментальной меланомы и ее метастазов при ингибировании матриксной металлопротеиназы-9

Матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9) — фермент, относящийся к представителям семейства цинкзависимых эндопептидаз, способных к деградации структурных компонентов базальной мембраны и внеклеточного матрикса [1]. Кроме способности индуцировать деградацию компонентов межклеточного матрикса, отмечено участие ММП-9 в аутокринном типе регуляции апоптоза, а также клеточной пролиферации и дифференцировке [2]. Имеются данные о том, что ингибирование экспрессии ММП-9 приводит к изменению активности других ферментов, в частности каспаз и антиоксидантных ферментов [3]. Описана активация каспазного каскада в клетках органов при изменениях экспрессии ММП-9 [4]. Каспаза-3 является одним из ферментов, принимающих участие в развитии апоптоза, нарушения которого регистрируются при онкологических заболеваниях. Результаты исследований показывают, что реализация программы апоптоза происходит при помощи активации семейства протеаз—каспаз и активация каспаз приводит к апоптозу [5]. Каспаза-3 наиболее часто активируется при апоптозе, что позволяет считать этот фермент одним из важнейших участников запрограммированной клеточной гибели. В исследованиях последних лет большую роль отводят неапоптотической роли каспазы-3, которая может выполнять в определенных ситуациях антиапоптотическую функцию и даже регулировать клеточный цикл [6]. Каспаза-3 играет важную роль в состоянии цитокинов. Синтезируемый клеткой в виде неактивной проформы интерлейкин-16 расщепляется и приобретает активную конформацию в результате ограниченного протеолиза, осуществляемого каспазой-3 [7]. В ряде публикаций подчеркнуто сходство механизмов дифференцировки и апоптоза в клетках различного происхождения, что подтверждает несомненную роль каспазы-3 для дифференцировки клеток разных линий.

Целью настоящего исследования стало изучение особенностей экспрессии каспазы-3 нормальными тканями организма, а также клетками меланомы кожи в условиях снижения активности ММП-9 in vivo.

В эксперименте использовали 8-недельных мышей-самок линии C57Bl6. Животные получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал «Столбовая»). Культура клеток меланомы В16 получена в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). При работе с экспериментальными животными соблюдали основные принципы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (2007 г.), а также в приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Животных содержали при естественном освещении со свободным доступом к воде и пище. Случайным образом они были разделены на 2 группы (контрольную и опытную), по 10 животных в каждой. Перевивка опухоли производилась путем подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10) по стандартным методикам. На 10-е сутки после трансплантации опухоли животным опытной группы было начато введение 5 нМ ингибитора MMП-9 I («Calbiochem»; 0,3 мл внутримышечно ежедневно однократно, в течение 7 сут). Все животные находились в эксперименте до естественной гибели. Внутренние органы животных забирали в течение 30 мин после их гибели. Исследовали препараты опухолевой ткани, легких, печени, селезенки, почек, сердца.

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к каспазе-3 («Novocastra», разведение 1:100). Для визуализации использовали систему детекции ready-to-use («Novocastra») и диаминобензидин («Novocastra») в качестве хромогена. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Положительно окрашенные клетки подсчитывали при увеличении 400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Оценивали количество положительно окрашенных клеток отдельно в опухолевых клетках, в том числе в клетках метастазов меланомы кожи и непораженной метастазами ткани органа. Интенсивность окрашивания оценивали в баллах: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное окрашивание, 3 — выраженное окрашивание. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле: S=1a+2b+3c, где а — процент слабоокрашенных ядер клеток, b — процент умеренноокрашенных ядер клеток, с — процент сильноокрашенных ядер клеток [8]. Определяли степень выраженности экспрессии ММП-9: 0—10 баллов — отсутствие экспрессии, 11—100 — слабая экспрессия, 101—200 — умеренная, 201—300 — выраженная.

Для всех данных определяли медиану и интерквартильный разброс в виде подсчета 25- и 75-процентилей. Для оценки достоверности различий между группами использовали критерий Манна—Уитни.

Во всех изученных нами образцах в цитоплазме клеток при микроскопическом исследовании наблюдалось характерное иммуногистохимическое окрашивание. При оценке экспрессии каспазы-3 в опухолевых клетках нами не выявлено значимых различий между исследуемыми группами (см.таблицу).

Таким образом, изучив особенности экспрессии каспазы-3 в различных органах экспериментальных животных при ингибировании ММП-9, можно отметить, что наибольшие изменения затрагивали органы, в которых обнаруживались метастазы меланомы — легкие, печень и селезенку, в которых и были выявлены значимые различия между контрольной и опытной группами (p<0,05), в отличие от сердечной и почечной тканей, где подобных различий не отмечалось. Полученные данные свидетельствуют о неселективном эффекте ММП-9 в отношении каспазы-3, что может приводить к развитию побочных эффектов при использовании ингибиторов ММП-9 в качестве противоопухолевых средств.